Toll様受容体シグナル伝達阻害のための生理活性ナノ粒子のスクリーニングアッセイ

誘導

性プロモーターの下に分泌された胚性アルカリホスファターゼ(SEAP)遺伝子または分泌されたルシフェラーゼ遺伝子を保有する異なるレポーターマクロファージを含むマルチウェルプレートを取ります。

リポ多糖類またはLPSと混合された異なるペプチド-金ナノ粒子ハイブリッドを含む培地を指定されたウェルに加えます。

LPS はマクロファージ トール様受容体 (TLR) に結合し、エンドソームへの内在化を引き起こします。

エンドソームプロトンポンプは、プロトンを内部に輸送します。酸性化はTLRシグナル伝達を引き起こし、転写因子を活性化します。

これらの因子はレポーター遺伝子の発現を誘導し、SEAPまたはルシフェラーゼを生成します。

あるいは、ハイブリッドとともにLPSの内在化により、負に帯電したペプチド基が管腔プロトンを隔離し、エンドソーム酸性化を防ぎ、TLRシグナル伝達を阻害します。

培地を回収し、遠心分離して上清を分離し、SEAPとルシフェラーゼの基質を加えます。

SEAP は基質を着色製品に変換し、ルシフェラーゼは基質を触媒して発光を生成します。

レポーターシグナルの減少は、TLRシグナル伝達阻害におけるハイブリッドの有効性を示しています。

1.5ミリリットルのエッペンドルフチューブに20容量のペプチド-GNPハイブリッド溶液を18,000倍gで30分間遠心分離します。上清を慎重に捨てます。ハイブリッドを単一の新鮮なチューブに移し、1ミリリットルのPBSで2回洗浄します。この後、洗浄したハイブリッドを1容量のR10培地に再懸濁します。ハイブリッドとLPSの最終濃度がそれぞれ100ナノモルと10ナノグラム/ミリリットルになるように、濃縮ハイブリッドとLPS含有R10培地を等量

混合します。

次に、マクロファージ培養プレートから培地を取り出します。100マイクロリットルのハイブリッドLPS混合物を各ウェルに加え、条件ごとに3回繰り返します。ネガティブコントロールとLPSコントロールを含めます。摂氏37度で24時間インキュベートし、次に、各ウェルの培地を別の遠心分離管に移します。チューブを摂氏4度で18,000倍gで30分間遠心分離します。上清を新鮮な96ウェルの丸い底板に移します。

これらのサンプルのレポーターアッセイを開始するには、180マイクロリットルの予熱したQUANTI-Blue溶液を新しい96ウェル平底プレートの各ウェルに加え、次に各サンプルから20マイクロリットルの上清をこのプレートに移します。濃い青色が1を超える光学密度に発達するまで、摂氏37度で1〜2時間インキュベートします。この後、プレートリーダーを使用して655ナノメートルでの吸収を記録します。次に、各サンプルから10マイクロリットルの新鮮な上清を96ウェルの透明な平底の白いプレートに移します。

自動注入器を使用して、50マイクロリットルのルシフェラーゼ溶液を各ウェルに加え、すぐにウェルごとに発光を記録します。次に、潜在的な候補の阻害効果を検証し、テキストプロトコルで概説されているTLR特異性を評価します。