感染マウスの臓器におけるウイルス力価を定量するためのフォーカス形成アッセイ

哺乳類細胞の単層を含むマルチウェルプレートを取ります。

感染したマウスのさまざまな臓器に由来するジカウイルスを含む組織ホモジネートの連続希釈液をウェルに接種します。

エンドサイトーシスを介して細胞に侵入すると、ウイルスは増殖して芽を出し、隣接する細胞に感染します。

高粘度のメチルセルロース溶液を重ねて、ウイルスの移動を制限する物理的なバリアを作成します。

このバリアは、感染した細胞の病巣を形成するすぐ隣接する細胞への感染のみを可能にし、各焦点が単一のウイルス粒子に由来することを保証し、正確な定量を可能にします。

細胞を固定し、膜を透過化します。細胞に入り、ウイルス抗原と相互作用する一次抗体を追加します。

一次抗体に結合するペルオキシダーゼ結合二次抗体を導入します。

ペルオキシダーゼによって変換される発色基質を追加して、感染した細胞の病巣を示す色付きの斑点を作成します。

病巣を数えて、マウスのさまざまな臓器のウイルス力価を定量化します。

均質化されたサンプルを摂氏マイナス80度の冷凍庫から取り出し、解凍します。サンプルを氷上に置いた状態で、ジカウイルスを希釈プレートの最初のウェルに10倍に希釈し、マルチチャンネルピペットを使用してプレートを10倍に連続希釈し、180マイクロリットルの増殖培地に20マイクロリットルのサンプルを加えて毎回チップを変更します。

各

希釈間でピペットチップを交換します。Vero細胞を覆う準備された平底96ウェルプレートから培地を取り出して、フォーカス形成プレートを準備します。単層が乾燥するのを防ぐために、Veroプレートの各ウェルに100マイクロリットルのウイルス希釈液を直ちに追加します。同じチップセットを使用して、最低濃度から最高濃度まで追加します。

ロックプレートを左右に2〜4回、摂氏37度、二酸化炭素5%で1〜2時間インキュベートします。2%メチルセルロースを室温まで温めます。次に、2%メチルセルロース溶液を成長培地中で約2対1の比率で希釈します。インキュベーション後、125マイクロリットルのメチルセルロース増殖培地を96ウェルプレートの各ウェルに加えます。摂氏37度、二酸化炭素5%で32〜40時間再度インキュベートします。

Vero細胞を固定するには、バイオセーフティキャビネットで、96ウェルプレートの各ウェルのメチルセルロース層の上に50マイクロリットルの5%パラホルムアルデヒドを追加します。室温で60分間インキュベートします。または、プレートをパラフィルムで覆い、摂氏4度で一晩置きます。

その後、ピペットを使用して、細胞からオーバーレイと培地を取り除き、バイオセーフティキャビネット内の使い捨て容器に入れます。ウェルあたり150マイクロリットルのPBSで穏やかに洗浄します。プレートからPBSを取り外し、バイオセーフティキャビネ