マクロファージにおける寄生虫の細胞内増殖を定量化するためのIn vitroアッセイ

骨髄由来のマクロファージまたはBMMを含むカバーガラスを含む2つのマイクロプレートを取ります。

リーシュマニアの異環性前鞭毛体(細長い鞭毛段階)を1つのプレートに追加し、アマスチゴート(楕円形の非鞭毛段階)を別のプレートに追加します。

インキュベーション中、寄生虫はマクロファージ受容体に結合し、受容体を介した食作用を引き起こします。

ファゴソームは、小胞体およびゴルジ体に由来するリソソームおよび小胞と融合し、寄生液胞に成熟します。

液胞のpHの低下は、前乳頭から無柱体への分化とその複製を引き起こします。

洗浄して、内在化されていない寄生虫を除去します。

感染したマクロファージを固定し、細胞と寄生虫を透過性化するために界面活性剤を加えます。

蛍光核酸色素を導入して、マクロファージと寄生虫核を染色します。

カバーガラスをスライドに取り付け、蛍光顕微鏡で観察し、大きな宿主核と周囲の小さな無柱体核を定量化します。

アマストゴートの数を比較して、最初に未分化プロマストゴートに感染したマクロファージと複製アマストゴートに感染したマクロファージ内での増殖を評価します。

細胞をL.アマゾネンシスに感染させるには、寄生虫懸濁液を適切な実験的感染の多重度に希釈し、実験のすべての時点を含むすべての6ウェルプレートの各ウェルに50〜100マイクロリットルの寄生虫を追加します。骨髄由来マクロファージを適切な感染期間と温度でインキュベートします。次に、ウェルあたりカルシウムまたはマグネシウムを含まない2ミリリットルの新鮮な摂氏37度PBSでウェルを3回洗浄し、最初の時点サンプルを1.5〜2ミリリットルの2%パラホルムアルデヒドで10分間固定します。

後の時点に対応するプレートについては、2ミリリットルの新鮮な骨髄由来マクロファージ培地を各ウェルに加え、プレートを適切なインキュベーターに戻します。次に、先ほど示したように、残りの各時点で細胞を固定して洗浄し、サンプルを摂氏4度で新鮮なPBSに保存します。

細胞をDAPIで染色するには、上清をカルシウムおよびマグネシウムを含まない1.5ミリリットルの新鮮なPBSに置き換え、室温で10分間0.1%非イオン性界面活性剤を補充し、続いてカルシウムまたはマグネシウムを含まないPBSで2ミリリットルを3回洗浄します。次に、1ミリリットルのPBSに1ミリリットルあたり2マイクログラムのDAPIで細胞を室温で1時間染色します。

3回洗浄した後、カバーガラスをセル側を下にして、市販の色あせ防止封入試薬が取り付けられた個々のガラス顕微鏡スライドに置きます。次に、感染細胞の数を定量化するために、蛍光顕微鏡とエマニュエルカウンターの100倍浸漬油対物レンズを使用して、DAPIで染色された各大きなマクロファージ核の周囲に集まった小さな無鞭子核の数を特定します。