抗菌タンパク質の酵素活性を定量するための色素放出アッセイ

熱殺した細菌懸濁液の入ったチューブから始めて、染料溶液で処理します。

色素分子は細菌の細胞壁の必須成分であるペプチドグリカンに共有結合し、青

色を与えます。

細菌をペレット化し、結合していない色素分子を含む上清を除去します。

細菌を再懸濁し、抗菌タンパク質溶液をチューブに導入すると、細菌ペプチドグリカンの酵素加水分解が引き起こされ、細胞壁の分解とそれに続く細胞溶解が起こります。

これにより染料分子が放出され、青色が与えられます。

タンパク質変性剤であるエタノールを加え、抗菌タンパク質を不活性化し、酵素反応を終了させます。

内容物を遠心分離して、細胞断片と酵素をペレット化します。色素分子を含む上清をマルチウェルプレートに移します。

プレートリーダーを使用して、595ナノメートルの吸光度を測定します。

酵素処理サンプルの吸光度を酵素処理されていないサンプルの吸光度と比較して、抗菌タンパク質の酵素活性を定量します。

色素放出アッセイでは、基質はレマゾールブリリアントブルーR色素またはRBBに共有結合しています。このプロトコルは、200ミリモルのRBB溶液を作成することから始めます。1.25グラムのRBBを新しく調製した水酸化ナトリウム溶液に溶解します。

次に、熱殺傷した細菌細胞を湿重量0.5グラムの濃度で30ミリリットルのRBB溶液に再懸濁します。精製されたペプチドグリカンの場合、ペプチドグリカンを0.3グラムの湿潤重量と30ミリリットルのRBB溶液の濃度で再懸濁します。

後続のステップは、使用する基質に関係なく同じであるため、標識は細菌細胞のみに対して実証されます。反応混合物を回転プラットフォーム上で摂氏37度で6時間インキュベートし、穏やかに混合します。6時間後、反応混合物を摂氏4度のインキュベーターに移し、穏やかに混合しながらさらに12時間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、染色した基質を3,000倍gで30分間遠心分離して収穫します。基質ペレットから染料溶液をデカントします。ペレットをタイプ1の水に完全に再懸濁し、続いて遠心分離します。この方法で色素標識細胞を3〜5回洗浄して、基質から非共有結合可溶性色素を除去します。

最終洗浄では、色素放出アッセイで使用されるペレット部分を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。最後の洗浄の上清は透明でなければなりませんが、基材は青色のままです。染色した基材を、マイナス20°Cの最小限の水に懸濁して、使用できるようになるまで保管してください。

色素放出アッセイの準備として、凍結染色基質を室温に戻し、酵素について経験的に決定したアッセイバッファーで2回洗浄します。この場合、PBSが使用されます。200マイクロリットルの反応量に、実行する色素放出アッセイの数を掛けて、必要な基質懸濁液の量を計