抗菌タンパク質の酵素活性を定量するための色素放出アッセイ

熱殺した細菌懸濁液の入ったチューブから始めて、染料溶液で処理します。

色素分子は細菌の細胞壁の必須成分であるペプチドグリカンに共有結合し、青

細菌をペレット化し、結合していない色素分子を含む上清を除去します。

細菌を再懸濁し、抗菌タンパク質溶液をチューブに導入すると、細菌ペプチドグリカンの酵素加水分解が引き起こされ、細胞壁の分解とそれに続く細胞溶解が起こります。

これにより染料分子が放出され、青色が与えられます。

タンパク質変性剤であるエタノールを加え、抗菌タンパク質を不活性化し、酵素反応を終了させます。

内容物を遠心分離して、細胞断片と酵素をペレット化します。色素分子を含む上清をマルチウェルプレートに移します。

プレートリーダーを使用して、595ナノメートルの吸光度を測定します。

酵素処理サンプルの吸光度を酵素処理されていないサンプルの吸光度と比較して、抗菌タンパク質の酵素活性を定量します。

色素放出アッセイでは、基質はレマゾールブリリアントブルーR色素またはRBBに共有結合しています。このプロトコルは、200ミリモルのRBB溶液を作成することから始めます。1.25グラムのRBBを新しく調製した水酸化ナトリウム溶液に溶解します。

次に、熱殺傷した細菌細胞を湿重量0.5グラムの濃度で30ミリリットルのRBB溶液に再懸濁します。精製されたペプチドグリカンの場合、ペプチドグリカンを0.3グラムの湿潤重量と30ミリリットルのRBB溶液の濃度で再懸濁します。

後続のステップは、使用する基質に関係なく同じであるため、標識は細菌細胞のみに対して実証されます。反応混合物を回転プラットフォーム上で摂氏37度で6時間インキュベートし、穏やかに混合します。6時間後、反応混合物を摂氏4度のインキュベーターに移し、穏やかに混合しながらさらに12時間インキュベートします。

インキュベーションが完了したら、染色した基質を3,000倍gで30分間遠心分離して収穫します。基質ペレットから染料溶液をデカントします。ペレットをタイプ1の水に完全に再懸濁し、続いて遠心分離します。この方法で色素標識細胞を3〜5回洗浄して、基質から非共有結合可溶性色素を除去します。

最終洗浄では、色素放出アッセイで使用されるペレット部分を1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに移します。最後の洗浄の上清は透明でなければなりませんが、基材は青色のままです。染色した基材を、マイナス20°Cの最小限の水に懸濁して、使用できるようになるまで保管してください。

色素放出アッセイの準備として、凍結染色基質を室温に戻し、酵素について経験的に決定したアッセイバッファーで2回洗浄します。この場合、PBSが使用されます。200マイクロリットルの反応量に、実行する色素放出アッセイの数を掛けて、必要な基質懸濁液の量を計算します。

基質懸濁液を調製するには、まず染色した基質を適切な量のPBSに加えます。1対1で希釈し、PBSをブランクとして使用して595ナノメートルでの光学密度の初期測定を行います。595ナノメートルで2.0の光学密度が達成されるまで、染色した基板を懸濁液に増分量を加えます。

このデモンストレーションでは、色素放出アッセイを使用して、タンパク質抗菌剤の最適なインキュベーション条件を決定します。まず、プロトコルテキストに記載されているように、PBSを使用して濃度を1ミリリットルあたり1ミリグラムに調整することにより、ストックタンパク質抗菌懸濁液を調製します。次に、ストックタンパク質抗菌懸濁液をマイクロリットルあたり100ナノグラムの濃度に希釈します。

この濃度は、アッセイ反応に添加された体積あたり1マイクログラムのタンパク質の最終反応質量を与える。評価する熱範囲について、0.5ミリリットルのマイクロフュージチューブで反応アッセイを実行します。熱条件ごとに、10マイクロリットルのストックタンパク質を200マイクロリットルの調製基質懸濁液に加えます。

サーマルサイクラーで8時間インキュベートし、1時間に1回反転して混合します。インキュベーション後、各マイクロフュージチューブに25マイクロリットルのエタノールを加えて反応を停止させます。未消化の不溶性基質を除去するには、3,000倍gで2分間遠心分離します。その後、未消化の基質のペレットを破壊しないように注意しながら、反応混合物ごとに150マイクロリットルの反応上清を96ウェル平底マイクロプレートに移します。

酵素活性を定量化するには、マイクロプレート分光光度計を使用して、595ナノメートルで上清の吸光度を測定します。標識基質から上清に放出される可溶性色素による吸光度の増加は、酵素活性の定量的測定です。