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パイオメラニンと非パイオメラニン産生細菌株の両方を試験剤で処理します。
細胞外色素であるパイオメラニンは、酸化ストレスに対する保護を提供します。
試験剤はピオメラニンの生合成を妨害し、その産生を減少させます。
インキュベーション後、試験剤またはビヒクル溶媒を含むバッファーを使用して連続細菌希釈を行います。
酸化的ストレス要因である過酸化水素濃度の異なる寒天プレート上の細菌希釈液をスポットします。
過酸化水素を欠いたプレートが対照として機能します。
インキュベート。コントロールプレートでは、細菌がコロニーを形成します。
未処理のパイオメラニン産生株では、パイオメラニンは細菌を過酸化水素誘発性の酸化損傷から保護し、色素沈着したコロニーをもたらします。
しかし、ピオメラニンの減少を示す試験剤で処理されたピオメラニン産生株は、酸化ストレスに感受性になり、細菌死に至ります。
コロニーを数えます。
対照よりも、処理されたピオメラニン産生株および処理済みおよび未処理の非パイオメラニン産生株の両方で過酸化水素濃度の増加に伴うコロニー数とサイズの減少は、酸化ストレスに対する細菌の感受性が高まっていることを示しています。
この手順を開始するには、NTBCの有無にかかわらず、LBで試験する株の一晩培養を設定します。翌日、酸化ストレッサーとして過酸化水素を含むLB寒天プレートを調製します。まず、LB寒天フラスコを溶かし、培地を室温で摂氏約50度まで冷却します。
次に、過酸化水素を所望の濃度で冷却媒体に直接添加します。フラスコを回して混ぜます。0〜1ミリモルの過酸化水素濃度の範囲は、良い出発点です。すぐにプレートを注ぎ、表面を炎上して気泡を取り除きます。収量は、LB寒天100ミリメートルあたり4プレートです。過酸化水素濃度をプレートにマークします。
プレートをカバーせずに生物学的フローフードに入れ、ファンを30分間作動させてプレートから余分な水分を取り除きます。プレートは、準備したその日に使用する必要があります。プレートが乾燥している間に、一晩培養物のOD600を洗浄して測定します。
すべてのオーバーナイト培養のOD600を、テスト対象の菌株セットの最小値に正規化します。これを行うには、培養物を1ミリリットルの総量で最低OD600に希釈するために必要な培養量を決定します。
たとえば、培養物のOD600が3で、一連の菌株の最小OD600が2.5の場合、次の計算を実行すると、必要な培養量として0.833ミリリットルになります。0.833ミリリットルの培養物をマイクロフュージチューブに入れます。次に、培養量を1ミリリットルにするために必要なLBとNTBCまたはLBとDMSOの量を計算します。この例では、量は 0.167 ミリリットルになります。ボルテックスで混合します。
培養物をNTBCまたはDMSOの一定濃度に維持するには、PBSとNTBCまたはPBSとDMSOで正規化されたオーバーナイト培養物を10倍に連続希釈します。PBSとNTBCおよびPBSとDMSOのストック溶液を、テストする菌株の数に応じてスケールアップまたはスケールダウンします。
1つの株に対して1セットの希釈液について、300マイクロモルのNTBCまたは同等の量のDMSOをPBSと混合して、合計720マイクロリットルの量を得ます。90マイクロリットルのPBSとNTBCまたはPBSとDMSOを、10からマイナス1から10からマイナス7の連続希釈液で標識した適切なマイクロフュージチューブに加えます。マイナス1希釈チューブに適切な10マイクロリットルの培養物を加えます。
ボルテックスで混合し、10の10マイクロリットルをマイナス1の希釈液から10のマイナス2希釈チューブに移します。希釈間でピペットチップを交換し、すべての希釈が実行されるまで繰り返します。
LBと過酸化水素プレートの10〜マイナス3〜マイナス7の希釈液のうち5マイクロリットルを、株ごとに2回ずつスポットします。スポットが最も希薄なものから最も希薄なものまでメッキされている場合は、1つのピペットチップを使用します。液体がプレートに乾くまで、プレートを傾けたり傾けたりしないでください。プレートを摂氏37度でインキュベートします。株にもよりますが、24〜48時間。適切なサイズのコロニーが現れたら、トランスイルミネーターの上のCCDカメラを使用してプレートを撮影します。