ブロス中のマイコバクテリアに対する試験化合物の有効性の評価

試験化合物であるアミノグリコシド系抗生物質の連続希釈液を含むマルチウェルプレートを取ります。

病原性細菌である結核菌の懸濁液をウェルに加え、インキュベートします。

細胞質では、試験化合物は抗酸菌30Sリボソームサブユニットに結合し、正常なタンパク質合成を阻害し、最終的には抗酸菌死につながります。

インキュベーション後、弱蛍光の水溶性色素であるレサズリンを培養物に加えます。インキュベート。

生存可能な代謝活性抗酸菌の内部では、デヒドロゲナーゼ酵素が青色のレサズリンをピンク色の蛍光レゾルフィンに還元します。

蛍光プレートリーダーを使用して、ウェル内のレゾルフィン蛍光強度を測定します。

試験化合物濃度の増加に伴う蛍光強度値が低いことは、マイコバクテリアに対する細胞毒性効果を示唆しています。

レザズリンアッセイを実行するには、結核菌を7H9ADSTで対数中期に増殖させます。培養物を7H9ADSTでOD₆₀₀ 0.01に希釈します。7H9ADSTを使用して化合物を試験濃度の2倍に希釈し、希釈した各化合物を100マイクロリットルを透明な96ウェルプレートの各ウェルに分注します。

100マイクロリットルの希釈した細菌懸濁液を各ウェルに移します。プレートを摂氏37度で加湿インキュベーターで5日間インキュベートします。10ミリグラムのレサズリンを100ミリリットルの脱イオン水に溶かし、溶液をろ過滅菌します。30マイクロリットルのレサズリン溶液をウェルに加えます。次に、細胞を48時間インキュベートします。

細菌の増殖は、青からピンクへの色変換によって示されます。テキストプロトコルに従って定量分析を実行します。