抗菌剤をスクリーニングするためのペグプレートバイオフィルムアッセイ

細菌のバイオフィルムでコーティングされた円筒形のサポートまたはペグを備えた蓋付きのマイクロタイタープレートを取ります。

バイオフィルムでコーティングされたペグ蓋をバッファー付きのマイクロタイタープレートウェルに置き、バイオフィルムに付着した測定に焦点を当てて、緩く付着した細菌や浮遊性細菌を除去します。

すすぎたバイオフィルムでコーティングされたペグ蓋を、試験抗菌剤濃度を上げたチャレンジプレートに移します。振らずにインキュベートします。

薬剤の濃度と抗菌能力に応じて、細菌の代謝活性とバイオフィルムの完全性を破壊します。

インキュベーション後、ペグの蓋を緩衝液を含むプレートウェルに置き、浮遊菌を除去します。

細胞透過性の弱蛍光色素であるレサズリンを含むバイオフィルム回収培地を使用して、マイクロタイタープレートウェルに移します。インキュベート。

代謝活性細菌では、デヒドロゲナーゼ酵素が青色のレサズリンをピンク色の蛍光レゾルフィンに還元します。

レサズリン変換の欠如はバイオフィルムの根絶を示し、レゾルフィンへの変換は生存細胞の存在を示唆しています。

レサズリン変換をもたらさない最低の試験抗菌剤濃度は、バイオフィルム根絶濃度が最小であることを示します。

新鮮な96ウェルプレートを取り、室温に平衡化した100マイクロリットルのCRPMIを列BからHの各ウェルに加えます。最大4つの試験化合物を1.0ミリリットルのCRPMIで別々に希釈し、所望の最終濃度の2倍に希釈します。ウェルA1からA3に200マイクロリットルの化合物1、ウェルA4からA6に200マイクロリットルの化合物2、ウェルA7からA9に200マイクロリットルの化合物3、ウェルA10からA12に200マイクロリットルの化合物4を追加します。

マルチチャンネルピペットを使用して試験化合物を連続的に希釈します。まず、100マイクロリットルをA列からB列に移し、混合します。このようにして、100マイクロリットルを井戸にうまく移し続けます。各移送後に混合し、列Fで停止します。混合後、F列から100マイクロリットルを廃棄物容器に排出します。G列とH列に液体を移さないでください。最後に、マルチチャンネルピペットを使用してプレートの各ウェルに100マイクロリットルのCRPMIを追加し、最終容量を200マイクロリットルにします。

200マイクロリットルのリン酸緩衝生理食塩水を、バイオフィルム開始プレートと同じ寸法のウェルを備えた新鮮な滅菌96ウェルプレートに加えます。次に、インキュベートしたバイオフィルム開始プレートからビニール袋とパラフィンフィルムを取り出します。バイオフィルムを損傷する可能性があるため、ペグとプレートの底が接触しないように、蓋をまっすぐ上に持ち上げます。後続のOD₆₀₀解析のために、下部を保持します。

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