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哺乳類の細胞を含むマイクロプレートを氷の上に取ります。
選択したウェルにカルシウムを含む培地を追加し、カルシウムを含まない培地を他のウェルに追加します。
細菌の細孔形成毒素のモノマーを導入します。低温はモノマーの凝集を防ぎ、細胞膜コレステロールへの結合を促進します。
生理学的温度でインキュベートし、コレステロール結合モノマーがオリゴマー化して膜に挿入され、細孔が形成されます。
細胞外カルシウムを含むウェルでは、細孔がカルシウムの流入を引き起こします。
流入は毒素のエキソソーム排出と膜の再密閉を引き起こします。
細胞内カルシウムの増加はリソソームエキソサイトーシスも誘導し、膜のスフィンゴミエリンをセラミドに変換する酵素を放出します。
セラミドが豊富な膜は毒素エンドサイトーシスを引き起こし、膜を再密閉します。
膜の再封は、細胞外カルシウムのないウェルでは妨げられます。
ヨウ化プロピジウムまたはPI(蛍光色素)を加えると、修復された膜では細胞に入ることができませんが、損傷した細胞に入ってDNAに結合し、蛍光を発します。
定義された間隔で蛍光を測定して、メンブレンの再シール効率を評価します。
修復許容条件のハイスループット蛍光ベースのアッセイを設定するには、ウェルあたり200マイクロリットルの摂氏37度M1培地で細胞を2回洗浄し、2回目の洗浄を廃棄した後、30マイクロモルのヨウ化プロピジウムを添加した100マイクロリットルの新鮮な摂氏37度のM1培地を追加します。
修復制限条件では、ウェルあたり5ミリモルのEGTAを添加した摂氏37度のM2培地200マイクロリットルで細胞を1回洗浄し、続いて200マイクロリットルのM2培地のみで
1回洗浄します。2回目の洗浄を廃棄した後、ウェルあたり30マイクロモルのヨウ化プロピジウムを添加した100マイクロリットルの新鮮な摂氏37度M2培地を加えます。次に、先ほど示したように、透過光、GFP、およびPIの下でプレートを画像化します。プレートをイメージングしている間に、96ウェルの丸底ポリプロピレンマイクロプレートを氷の上に置き、前のプレートで示したようにプレートを構成します。
修復許容条件では、ウェルあたり60マイクロモルのヨウ化プロピジウムを添加した100マイクロリットルの氷冷M1培地を追加し、続いてウェルあたり4倍のリステリオリシンOの有無にかかわらず100マイクロリットルの氷冷M1
を加えます。修復制限条件の場合は、ウェルあたり60マイクロモルのヨウ化プロピジウムを添加した100マイクロリットルの氷冷M2培地を追加し、続いてウェルあたり4倍のリステリオリシンOの有無にかかわらず100マイクロリットルの氷冷M2を追加します。
プレート1が氷上にあり、プレート2が準備されている場合は、キネティックアッセイの開始の約5分前に、氷上で適切な実験濃度でリステリオリシンOを調製することが不可欠です。
最初のプレートのイメージングが終了したら、すぐにプレートを氷上のアルミホイルのシートに転写します。5分後、2番目のプレートの各ウェルから100マイクロリットルを最初の冷却プレートの対応する適切なウェルに移し、各ウェルの溶液のメニスカスの下にピペットチップを挿入してから、毒素の適切な分布のために混合せずにボリュームを排出します。
毒素を宿主細胞に1分間結合させ、すぐに最初のプレートをプレートリーダーに移し、分光蛍光計モードを使用してポストキネティックアッセイを行います。キネティックアッセイの最後に、プレキネティックイメージングで実証されているように、プレートイメージのポストキネティックイメージングをすぐに取得します。