狂犬病ウイルス抗原検出のための免疫組織化学染色

ホルマリン固定、パラフィン包埋狂犬病ウイルス感染マウス脳組織切片を運ぶスライドから始めます。固定部分は、タンパク質架橋を介してウイルス抗原を保持します。

スライドをキシレン溶液で処理してパラフィンを除去します。

スライドを減少するエタノール濃度に浸して組織を再水和し、水溶液と適合させます。

プロテアーゼ含有バッファーを導入してタンパク質架橋を破壊し、抗原へのアクセスを改善します。

過酸化水素に浸して内因性ペルオキシダーゼをブロックし、ブロッキング溶液を塗布して非特異的相互作用を防ぎます。

狂犬病抗原に特異的な一次抗体を導入し、抗原抗体複合体を形成します。

一次抗体に結合するビオチン化二次抗体を追加します。ビオチンと相互作用するストレプトアビジン結合ペルオキシダーゼ酵素とインキュベートします。

ペルオキシダーゼ基質を導入し、マゼンタレッドの沈殿物を生成します。

核染色で組織を対比染色し、続いてブルーイング剤を塗布し、核を青く染色します。

免疫組織化学画像は、細胞質にマゼンタレッドの斑点を明らかにし、組織切片に狂犬病抗原が存在することを確認します。

ミクロトームを使用して、5マイクロメートルのパラフィン切片を作成します。セクションを摂氏38度のウォーターバスに浮かせ、スライドガラスに集めます。試薬耐性ペンでスライドにラベルを付けます。スライドをトレイに置き、摂氏55〜60度のオーブンで1時間溶かします。

次に、スライドをオーブンから取り出し、それぞれ5分間のキシレンすすぎを3回連続して使用して、すぐに脱パラフィンします。この後、テキストプロトコルに概説されているように、エタノールの希釈を減らして脱イオン水に連続的に浸漬することにより、スライド上のセクションを再水和します。

タンパク質分解抗原回収のためにスライドをプロテアーゼで30分間処理し、次に、スライドをPBSTで10分間すすぎ、3%過酸化水素で10分間処理します。この後、スライドをPBSTで10分間再度洗浄します。

まず、バッファーから 1 枚のスライドを取り出し、一度に 1 枚のスライドのみを処理し、他のスライドは水没したままにし、ペーパータオルを使用して組織切片の周囲から余分なバッファーを吸い取ります。スライドを湿度チャンバーに入れ、通常のヤギ血清と室温で15分間インキュベートします。

次に、スライドを湿度チャンバー内で、最適な希釈率の一次抗狂犬病抗体および陰性対照抗体とともに室温で60分間インキュベートし、その間に洗浄しません。この後、スライドをPBSTで10分間洗浄し、ビオチン化抗体とともに湿度チャンバーで室温で15分間インキュベートします。

スライドをPBSTで10分間再度洗浄します。スライドをストレプトアビジン-HRP複合体を含む湿度チャンバー内で室温で15分間インキュベートし、PBSTを10分間洗浄します。次に、室温の湿度チャンバーでAECと10分間インキュベートします。スライドを脱イオン水で10分間洗浄し、脱イオン水で1〜2に希釈したギルのヘマトキシリンで2分間対比染色します。

この後、スライドを脱イオン水に浸して洗い流して、余分なヘマトキシリンを洗い流します。スライドをスコットの水道水で30秒間すすぎ、脱イオン水で10分間洗浄します。スライドを1枚ずつ取り外し、水溶性の封入剤で取り付けます。次に、光学顕微鏡を使用してスライドを読み取ります。