マウス精巣におけるタンパク質結合RNAの効率的な同定のための強化された架橋免疫沈降法

採取したてのマウス精巣を冷やした緩衝液に収めます。線維組織層である白膜を取り除きます。

精巣を粉砕して、生殖細胞とセルトリ細胞を含む精細管を放出します。

バッファーを加え、尿細管をUV放射にさらして、RNAと関連タンパク質の不可逆的な架橋を行い、相互作用を維持します。

遠心分離して上清を廃棄します。

尿細管をRNaseおよびプロテアーゼ阻害剤を含む溶解バッファーに再懸濁します。

組織を超音波処理し、タンパク質 - RNA複合体および他の細胞内成分を放出します。RNaseおよびプロテアーゼ阻害剤は、内因性RNaseおよびプロテアーゼを不活性化します。

DNaseを添加してDNAを分解します。部分的なRNA消化のために希釈したRNアーゼを導入します。

RNA-タンパク質複合体を含む上清を遠心分離し、標的RNA結合タンパク質に対して高い特異性を持つ抗体でコーティングされた磁気ビーズ溶液に移します。

磁場を印加して、ビーズ結合タンパク質-RNA複合体を分離します。上清を捨てます。

バッファーで洗浄します。タンパク質-RNA複合体を磁気的に分離し、さらなるRNA-タンパク質相互作用分析に使用します。

この手順を開始するには、免疫沈降実験ごとに適切な年齢のマウスから約100ミリグラムの精巣を採取します。組織を氷冷のPBSに入れます。先端の細いピンセットを使用して、白膜をそっと取り除きます。3ミリリットルの氷冷PBSをティッシュグラインダーに加え、緩いガラス乳棒を使用して穏やかな機械的力で組織を粉砕します。次に、組織懸濁液を細胞培養皿に移し、最大6ミリリットルの氷冷PBSを加えます。液体が皿の底を均等に覆うようにプレートをすばやく振ってください。

氷上の懸濁液を254ナノメートルで400ミリジュール/センチメートル平方で3回架橋します。各照射の間に懸濁液を混合し、15ミリリットルの円錐形のチューブに懸濁液を回収し、1,200倍g、4度で5分間遠心分離します。上清を取り除き、ペレットを1ミリリットルのPBSに再懸濁します。この後、懸濁液を1.5ミリリットルの遠心分離管に移します。1,000 倍 g と 4 °C で 2 分間遠心分離し、上清を廃棄します。

まず、サンプルあたり125マイクロリットルのプロテインA磁気ビーズを新しい遠心分離管に加えます。チューブを磁石の上に置き、ビーズを溶液から分離します。10秒後、上清を取り除き、1ミリリットルの氷冷溶解バッファーでビーズを2回洗浄します。ビーズを10マイクログラムのeCLIP抗体を含む100マイクロリットルのコールドライシスバッファーに再懸濁します。チューブを室温で45分間回転させてから、1ミリリットルの氷冷溶解バッファーでビーズを2回洗浄します。

まず、22マイクロリットルの50X EDTAフリータンパク質阻害剤カクテルと11マイクロリットルのRNAse阻害剤を含む1ミリリットルの低温溶解バッファーに組織ペレットを再懸濁します。サンプルを氷上で15分間溶解し続けます。超音波処理各サンプルはテキストプロトコルで概説されています。次に、各チューブに4マイクロリットルのDNAseを加え、よく混合します。1,200RPMで振とうしながら、摂氏37度で10分間インキュベートします。この後、10マイクロリットルの希釈RNAseを加え、よく混ぜます。摂氏37度で1,200RPMで振とうしながら5分間インキュベートします。

次に、15,000倍g、摂氏4度で20分間遠心分離して、ライセートを除去します。上清を慎重に収集します。まず、調製したビーズに1ミリリットルのライセートを加え、サンプルを摂氏4度で2時間または一晩回転させます。この後、磁気スタンドでビーズを集め、上清を捨てます。ビーズを900マイクロリットルの高塩緩衝液で2回洗浄し、次にビーズを900マイクロリットルの洗浄緩衝液で2回洗浄します。