JoVE 実験百科事典
免疫学
0 回視聴 • 6:20 分 • July 8th, 2025
異なる細胞周期段階の抗原特異的CD8 + T細胞を含む抗原免疫マウスから二次リンパ器官細胞を採取します。
G1、S、G2、およびMは活発に分裂する細胞の段階であり、G0段階の細胞は静止しています。
蛍光生存率色素を加えて死細胞を標識し、蛍光色素タグ付き抗体をT細胞表面マーカーCD3およびCD8に結合させます。
蛍光色素結合抗原ペプチド-MHC多量体を導入してT細胞受容体に結合し、抗原特異的T細胞を標識します。
バッファーを使用して、細胞を固定し、透過処理します。
蛍光色素タグ付き抗体を導入して、細胞増殖関連核タンパク質に結合し、活発に分裂している細胞を染色します。
蛍光染色剤を添加してDNAを標識します。
フローサイトメトリーを使用して、生細胞を選択し、表面結合標識を介して抗原特異的CD8+ T細胞を同定します。
DNA染色強度は、DNA量の少ないG0およびG1細胞と、DNA量の多いS、G2、およびM細胞を区別します。核タンパク質特異的抗体がないため、G0細胞が分離されます。
10X透過処理バッファーを蒸留水で希釈して、新鮮な1X透過処理洗浄バッファーを調製し、0.45マイクロメートルのフィルターでろ過して凝集体を除去します。モノクローナル抗体Ki67-FITCを1X透過処理洗浄バッファーで希釈し、滴定実験で測定し、サンプルあたり100マイクロリットルの最終容量にします。
3ミリリットルの 1X 透過処理洗浄バッファーを細胞を含む各チューブに加え、室温で 400 g で 5 分間遠心分離します。上清を捨てます。ここでも、1X透過処理洗浄バッファーを加え、遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。
100マイクロリットルの希釈モノクローナル抗体Ki67-FITCをペレットに加え、ボルテックスして暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4ミリリットルの1X透過処理バッファーで2回洗浄し、各洗浄後に遠心分離し、上清を廃棄します。
フローサイトメーターで直接取得するサンプルの場合は350マイクロリットルのPBSを細胞ペレットに加え、DNA染色のためにヘヒストとインキュベートするサンプルの場合は細胞ペレットに250マイクロリットルのPBSを加えます。Hoechst 溶液と PBS 溶液を調製し、各サンプルに加えて、最終濃度が 2 マイクログラム/ミリリットルになるようにします。サンプルをボルテックスし、暗所で15分間インキュベートします。次に、サンプルを5分間遠心分離し、350マイクロリットルのPBSを細胞ペレットに加えます。
ソフトウェアを開き、ワークスペースリボンセクションの[グループの作成]をクリックして、分析するさまざまな臓器に対応するさまざまなグループを作成します。グループ名をダブルクリックして「グループの変更」ウィンドウを開き、関数「同期」にチェックマークを付けて、新しく作成したグループを同期します。
各 FCS ファイルを対応するグループにドラッグし、LN グループから始まるゲーティング戦略を作成します。完全に染色されたサンプルをダブルクリックしてグラフウィンドウを開き、このサンプルで取得した未添加イベントをドットプロットで表示します。x軸とy軸は、この原稿のフローサイトメーター設定ファイルの表2に示されているように、FCSファイルと同様にラベル付けされていることに注意してください。適切な視覚化のために十分な数のイベントが表示されていることを確認します。
必要に応じて、ワークスペースリボンのハートアイコンをクリックして[環境設定]を開き、[グラフ]、[グラフタイプとしてドットプロット]の順に選択し、対応するボックスに描画されたドットの数が正しいことを確認するか、変更します。グラフウィンドウに、x軸にDNA-A、y軸にDNA-Wのドットプロットで表示します。両方の軸に線形スケールを使用します。必要に応じて、グラフウィンドウの各軸の近くにTで示されたボックスをクリックして、スケールを対数から線形に変更します。
[ゲーティングツール]セクションの[長方形]をクリックして単一細胞集団を選択し、長方形のゲートの中央をダブルクリックして、x軸にFSC-Aパラメータ、y軸にデッドセル色素のドットプロットで単一セルを表示します。
ポリゴンをクリックして、死細胞色素に対して陰性の生細胞集団を選択します。ポリゴン ゲートの中央をダブルクリックすると、X 軸に FSC-A パラメーター、y 軸に SSC-A パラメーターのドット プロットにセルが表示されます。
[長方形] をクリックし、そのグラフにすべての単一のライブ セルを含める「緩和された」ゲートを作成します。緩和ゲートの中央をダブルクリックして、x軸にCD3、y軸にCD8のドットプロットでセルを表示します。
グラフウィンドウでの視覚化に適切な軸スケールを使用します。必要に応じて、各軸の近くに T で示されたボックスをクリックして、x と y のスケールを変更します。軸関数のカスタマイズ(Customize Axis Function)を選択し、必要に応じて「余分負のディケード」、「幅の基準」(Width Basis)、および「正のディケード」(Positive Decades) を変更します。
[Polygon]をクリックして、CD3陽性、CD8陽性の細胞を選択します。CD3陽性、CD8陽性ゲートの中央をダブルクリックして、x軸にTetr-gag、y軸にPent-gagのドットプロットで細胞を表示します。Polygonをクリックして、抗原特異的CD8 T細胞を選択します。ギャグ特異的ゲートの中央をダブルクリックして、x軸にDNA-A、y軸にKi67のドットプロットで細胞を表示します。グラフウィンドウの[ゲーティングツール]セクションの[クワッド]をクリックして、さまざまな細胞周期フェーズのセルを選択します。