抗原特異的CD8⁺ T細胞の細胞周期解析のためのアッセイ

異なる細胞周期段階の抗原特異的CD8 ⁺ T細胞を含む抗原免疫マウスから二次リンパ器官細胞を採取します。

G₁、S、G₂、およびMは活発に分裂する細胞の段階であり、G₀段階の細胞は静止しています。

蛍光生存率色素を加えて死細胞を標識し、蛍光色素タグ付き抗体をT細胞表面マーカーCD3およびCD8に結合させます。

蛍光色素結合抗原ペプチド-MHC多量体を導入してT細胞受容体に結合し、抗原特異的T細胞を標識します。

バッファーを使用して、細胞を固定し、透過処理します。

蛍光色素タグ付き抗体を導入して、細胞増殖関連核タンパク質に結合し、活発に分裂している細胞を染色します。

蛍光染色剤を添加してDNAを標識します。

フローサイトメトリーを使用して、生細胞を選択し、表面結合標識を介して抗原特異的CD8⁺ T細胞を同定します。

DNA染色強度は、DNA量の少ない_G0およびG₁細胞と、DNA量の多いS、G₂、およびM細胞を区別します。核タンパク質特異的抗体がないため、G₀細胞が分離されます。

10X透過処理バッファーを蒸留水で希釈して、新鮮な1X透過処理洗浄バッファーを調製し、0.45マイクロメートルのフィルターでろ過して凝集体を除去します。モノクローナル抗体Ki67-FITCを1X透過処理洗浄バッファーで希釈し、滴定実験で測定し、サンプルあたり100マイクロリットルの最終容量にします。

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ミリリットルの 1X 透過処理洗浄バッファーを細胞を含む各チューブに加え、室温で 400 g で 5 分間遠心分離します。上清を捨てます。ここでも、1X透過処理洗浄バッファーを加え、遠心分離して細胞をペレット化し、上清を廃棄します。

100マイクロリットルの希釈モノクローナル抗体Ki67-FITCをペレットに加え、ボルテックスして暗所で30分間インキュベートします。インキュベーション後、細胞を4ミリリットルの1X透過処理バッファーで2回洗浄し、各洗浄後に遠心分離し、上清を廃棄します。

フローサイトメーターで直接取得するサンプルの場合は350マイクロリットルのPBSを細胞ペレットに加え、DNA染色のためにヘヒストとインキュベートするサンプルの場合は細胞ペレットに250マイクロリットルのPBSを加えます。Hoechst 溶液と PBS 溶液を調製し、各サンプルに加えて、最終濃度が 2 マイクログラム/ミリリットルになるようにします。サンプルをボルテックスし、暗所で15分間インキュベートします。次に、サンプルを5分間遠心分離し、350マイクロリットルのPBSを細胞ペレットに加えます。

ソフトウェアを開き、ワークスペースリボンセクションの[グループの作成]をクリックして、分析するさまざまな臓器に対応するさまざまなグループを作成します。グループ名をダブルクリックして「グループの変更」ウィンドウを