DNAベースのテンションプローブを使用して、免疫細胞によって加えられる受容体の力を評価する

まず、ポリエチレングリコール固定金ナノ粒子を使用した機能化ガラスカバーガラスから始めます。

反対側のアームに2つのオリゴヌクレオチドとハイブリダイズしたDNAヘアピンを含むDNAヘアピンテンションプローブを追加します。

リガンド鎖には蛍光色素とビオチンが含まれ、アンカー鎖には消光剤とチオール基が含まれています。このセットアップでは、クエンチャーが蛍光を抑制します。

DNAプローブは金ナノ粒子に結合し、ガラスカバーガラスに固定します。

リガンド鎖のビオチン分子と相互作用するストレプトアビジンを導入します。

事前に結合したストレプトアビジン分子に結合するビオチン化リガンドを追加します。

カバーガラスにCD8陽性T細胞を重ねます。それらの受容体は固定化されたリガンドと相互作用し、受容体-リガンド相互作用部位を形成します。

この相互作用により、DNA ヘアピン構造を展開する力が発生し、蛍光色素を消光剤から分離し、蛍光発光を促進します。

蛍光シグナルを維持するために、プローブの展開されたセグメントと相互作用する非蛍光ロック鎖を導入します。

蛍光を定量化して、免疫細胞によって加えられる受容体力を評価します。

まず、25 ミリメートルのカバーガラスを 50 ミリリットルのビーカーに入れたポリテトラフルオロエチレン ラックの上に置き、カバーガラスを水に浸して 3 回すすいでください。等量のエタノールと水を混合し、ラックとカバーガラスを含むビーカーにこの溶液40ミリリットルを加えます。次に、パラフィルムテープを使用してビーカーを密封します。

超音波洗浄機でビーカーを15分間超音波処理してカバーガラスを洗浄し、超音波処理後に液体を廃棄します。次に、ラックとカバーガラスの入ったビーカーを水で少なくとも6回すすぎ、残っている有機溶媒を除去します。新鮮なピラニア溶液を調製するには、30ミリリットルの硫酸を50ミリリットルのビーカーに加え、10ミリリットルの過酸化水素をゆっくりと加えます。ガラスピペットの端を使用してピラニア溶液をそっと混合します。

エッチングを開始するには、カバーガラスを保持するラックをピラニア溶液の入ったビーカーに移し、室温で30分間インキュベートしてカバーガラスを洗浄し、ヒドロキシル化します。次に、スチールまたはポリテトラフルオロエチレンピンセットを使用してラックを清潔な50ミリリットルビーカーに移し、水で6回すすいでください。水を完全に除去するには、カバーガラスを保持するラックを40ミリリットルのエタノールを入れた50ミリリットルのビーカーに浸し、エタノールを廃棄します。

次に、3% アミノプロピル トリエトキシ シランを含む 40 ミリリットルのエタノールにラックを室温で 1 時間浸漬し、カバーガラス上のヒドロキシル基との反応を開始します。カバーガラスの表面を40ミリリットルのエタノールに浸して6回すすぎ、80°Cのオーブンで20分間乾燥させます。

ペトリ皿の内側の底をパラフィルムテープで覆い、カバーガラスがペトリ皿内で滑りないようにします。次に、アミンで覆われたカバーガラスを、DNA張力プローブで官能化する面を上に向けて配置します。将来の使用のために、カバーガラスを摂氏マイナス20度で覆います。

カバーガラス上のアミン基を修飾するには、リポ酸-PEG-NHSおよびmPEG-NHSを加え、ペトリ皿を室温で1時間インキュベートします。インキュベーションの最後に、表面を水で3回すすいでください。その後、1ミリリットルあたり1ミリグラムのスルホ-NHS-酢酸を含む100マイクロリットルの0.1モル重炭酸ナトリウムをサンドイッチカバーガラスのセットに加え、不動態化が起こるまで30分間インキュベートします。

各カバーガラスに0.5ミリリットルの金ナノ粒子を加え、室温で30分間インキュベートします。インキュベーション後、カバーガラスを水で3回すすいでください。ブラックホールクエンチャー2鎖をアニールしたDNAテンションプローブに10対1の比率で添加した後、2つのカバーガラスごとに100マイクロリットルの混合物を加えてサンドイッチを作ります。

濡れたラボティッシュボールをカバーガラスから離してシャーレに慎重に置き、溶液が乾燥しないようにパラフィルムテープで皿を密封します。その後、皿をホイルで覆い、摂氏4度で一晩インキュベートします。翌日、チャンバーを締めながら表面のひび割れに注意しながらイメージングチャンバーを組み立てます。次に、0.5〜1ミリリットルのハンクバランス塩溶液をイメージングチャンバーに加えます。

100倍の対物レンズを備えたCy3Bチャネルを使用して、DNAヘアピンテンションプローブにプレーティングされた細胞の蛍光シグナルを、拡散し始めたときに捕捉します。100マイクロモルの非蛍光ロッキングストランドストックを調製した後、所望の時点で、イメージングチャンバー内の最終濃度1マイクロモルで細胞に添加して張力シグナルを保存し、ピペッティングによって細胞と混合します。

約10分間のロック後、定性的張力マッピングと定量分析の両方のために、落射蛍光でタイムラプスムービーまたはエンドポイント画像を取得します。