感染マウスのドレナージリンパ節への皮膚樹状細胞の移動を監視するためのCFSEベースのアッセイ

麻酔をかけたマウスを取ります。Mycobacterium bovis BCG懸濁液を後足パッドに注入します。

皮膚樹状細胞はマイコバクテリアを認識して貪食します。

さらに、処理された抗酸菌成分は、MHCクラスII分子上に提示されます。

細胞透過性CFSE色素を同じフットパッドに注入します。

細胞内エステラーゼはCFSEを切断して細胞不透過性蛍光生成物にし、細胞を染色します。

さらに、活性化された樹状細胞はリンパ管を介して膝窩リンパ節に移動し、T 細胞を活性化します。

膝窩リンパ節を外科的に切除し、ストレーナーで均質化し、単一細胞懸濁液を得る。

細胞を遠心分離し、バッファーに再懸濁します。

細胞をフローサイトメトリーチューブに移します。遠心分離し、抗体カクテルで細胞を処理します。

Fc 遮断抗体は Fc 受容体をブロックし、蛍光色素タグ付き抗体は免疫細胞上の表面マーカー CD11c および MHC クラス II 分子に結合します。

フローサイトメトリーを使用して、MHC-IIが高く、CD11cの発現が低いCFSE標識皮膚樹状細胞を同定し、リンパ節への移動を確認します。

ウ

シ菌BCG注射の場合、つま先つまみで適切な鎮静レベルを確認した後、29ゲージのハーフインチ針を装着した注射器を使用して、8〜12週齢のマウスの後足パッドに1 x 10⁶コロニー形成単位の細菌と30マイクロリットルのPBSを接種します。PBSのみでコントロールフットパッドを注入します。次に、動物が完全に横になり、注入されたフットパッドに体重をかけることができるようになるまで動物を監視します。

CFSE注射の場合、BCG注射後の適切な時点で、室温5ミリモルのCFSEのバイアルをPBSで10倍に希釈し、溶液を完全に再懸濁するように注意します。次に、希釈したCFSEをシリンジにロードし、最初の注射を受けたのと同じ後足パッドに20マイクロリットルを投与します。CFSE注射の24時間後、後ろももを慎重に垂直切開し、筋肉脂肪を取り除きます。

次に、はさみとピンセットを使用して、膝のくぼみの脂肪嚢の奥深くにある膝窩リンパ節を露出させ、切除します。リンパ節を氷上の0.5ミリリットルの滅菌PBSに移し、3ミリリットルのシリンジのバックエンドを備えた5ミリリットルのPBSを含む6ウェルプレートの1つのウェル内の70ミクロンの細胞ストレーナーを介してリンパ節を均質化します。ストレーナーをさらに5ミリリットルのバッファーで洗浄し、細胞溶液を15ミリリットルのチューブに移します。次に、細胞を遠心分離し、ペレットを十分な量のバッファーに再懸濁します。

フローサイトメトリー用に細胞を標識するには、1〜10 x 10⁶細胞を5ミリリットルの丸い丸底ポリスチレンチューブに分注し、新しいFACSバッファーで細胞を洗浄します。抗マウ