初代ヒト免疫細胞の抗真菌活性のリアルタイム評価

ヒト好中球(または免疫細胞)の懸濁液を含むガラスベースのイメージングディッシュから始めて、蛍光イメージングシステムの下で視覚化します。

遺伝子組み換え蛍光アスペルギルスレポーター分生子(または真菌の胞子)を導入し、最大6時間の一定間隔で画像をキャプチャします。

真菌の胞子は赤色蛍光タンパク質を発現し、非分解性のマゼンタ蛍光色素で外部標識されており、死んだ細胞と生きた細胞を区別するのに役立ちます。

インキュベーション中、好中球はパターン認識受容体を介して分生子上の病原体関連分子と相互作用し、ファゴソーム内でのそれらの飲み込みを促進します。

その後、ファゴソームは酵素含有リソソームと融合し、ファゴリソソームを形成します。

ファゴリソソーム内では、活性酸素種と酵素が分生子を分解します。

生細胞イメージング中、最初の時点で、好中球のファゴソーム内の強い赤色およびマゼンタ色の蛍光は、生きた分生子の存在を示します。

時間が経つにつれて、マゼンタ蛍光の保持に伴う赤色蛍光の減少は分生子の分解を示し、好中球の抗真菌活性を確認します。

顕微鏡検査中にDsRedとAlexaFlour 633を視覚化するには、顕微鏡ヒーターを予熱し、顕微鏡とコンピューターの電源を入れます。次に、100マイクロリットルの3×10を1ミリリットルあたり6番目のFLARE分生子懸濁液をイメージング皿の適切なウェルに加えます。FLARE分生子が追加された時刻を記録します。

イメージングディッシュを顕微鏡ステージに取り付けます。次に、取得設定でレーザー出力を10%、露光時間を1秒に設定し、DsRedとAF 633の鮮明で露出オーバーのない画像が得られるようにカメラ感度を調整し、ステージポイントのリストを設定します。すべてのポイントに焦点が合い、蛍光チャネルが最適化され、サイクルタイムと持続時間が設定されたときにイメージングを初期化します。