感染した初代マクロファージにおける細胞質および液胞性サルモネラ菌の定量化アッセイ

骨髄由来マクロファージの培養を取ります。培地を取り除き、蛍光細胞質タンパク質を発現するサルモネラ菌を加えます。

細菌とマクロファージの接触を促進するために遠心分離し、インキュベートします。

細菌はマクロファージ受容体に結合し、ファゴソーム内の内在化を促進します。

ファゴソームはエンドソーム由来の小胞と融合し、同時に細菌はエフェクターを分泌し、ファゴソームをサルモネラ菌含有液胞またはSCVに改造します。

SCVのサブセットが破裂し、内在化された細菌が細胞質に放出されます。

抗

生物質を加えて、内在化されていない細菌を排除します。死んだ細菌を含む培地を吸引します。

コレステロールに結合する界面活性剤ジギトニンを含む緩衝液を導入します。

コ

レステロールが豊富な原形質膜に結合するデジトニンは細孔形成をもたらしますが、コレステロール欠乏のSCV膜は無傷のままであり、この現象は異なる透過処理と呼ばれます。

透過処理された細胞に侵入して細胞質ゾル細菌に結合する蛍光標識抗体を追加します。

界面活性剤を使用して細胞と SCV を溶解し、内在化した細菌をすべて放出します。

フローサイトメトリーを使用して、二重染色細胞質ゾル細菌と単一染色液胞細菌を定量します。

感染の1日前に、ストレプトマイシンとアンピシリンを添加した3ミリリットルのルリアベルタニ培地に細菌株を摂氏37度のシェーカーで一晩接種します。個々の条件を考慮して、コントロールとして使用する24ウェルプレートのウェルにカバーガラスを追加します。

感染のために細胞をプレーティングするには、野生型骨髄由来マクロファージまたはBMDMを1ミリリットルの初代マクロファージ培地にウェルあたり12万5,000細胞の密度で供給します。次に、細胞を摂氏37度、二酸化炭素5%のインキュベーターで一晩インキュベートします。

翌日、リン酸緩衝生理食塩水に対する希釈培養物の600ナノメートルまたはOD₆₀₀での光学密度を測定することにより、一晩培養中のサルモネラ菌の濃度を測定します。これにより、OD₆₀₀が分光光度計の線形範囲で測定されます。

ミリリットルあたりのサルモネラ菌の濃度を計算します。OD₆₀₀ の 1 は 10 億個の細菌に相当します。マクロファージ培地で細菌を希釈して、1ミリリットルあたり125万個の細胞のサルモネラ菌濃度に達します。

細胞をサルモネラ菌で感染させるには、BMDMから培地を取り除きます。1ミリリットルのマクロファージ培地を未感染のコントロールウェルB1〜B3およびC1〜C3に加え、次に1ミリリットルのサルモネラ菌懸濁液をウェルA1〜A5に加えて、細胞あたり10個の細菌の感染の多様性に達します。

プレートを300倍g、摂氏37度で15分間遠心分離して感染を同期させてから、プレートを移して摂氏37度、二酸化炭素5%でインキ