前処理されたヒト血小板のコラーゲン誘発凝集をモニターするための比濁分析

まず

、非活性化血小板とフィブリノーゲン(血漿糖タンパク質)を含む前処理済みのヒト血小板懸濁液を含むガラスキュベットから始めます。

キュベットには、均一に混合するための撹拌装置が含まれています。

コントロールキュベットを凝集計に入れ、濁度を評価することによって凝集を測定します。

血

小板凝集のアゴニストであるコラーゲンを導入し、血小板の表面受容体と相互作用し、下流のシグナル伝達カスケードを活性化します。

これにより、パネキシン 1 チャネル (血小板表面チャネル) を介して ATP が放出され、血小板の活性化と形状変化が開始され、凝集曲線が低下します。

フィブリノーゲンはさらに活性化された血小板を架橋し、コラーゲン誘発性血小板凝集を促進し、濁りを変化させ、凝集曲線を徐々に上昇させます。

このチャネルをブロックする高濃度のパンネキシン1チャネル阻害剤でテストキュベットを処理します。

キュベットにコラーゲンを加えます。阻害剤の相互作用は、ATPの放出を妨げ、コラーゲン誘発性血小板凝集を妨げますが、これは濁度の変化と凝集曲線が平坦であることから明らかです。

多血小板血漿を調製するには、採取した血液の5ミリリットルのアリコートを15ミリリットルのチューブに移し、サンプルを250倍gと摂氏37度で13分間遠心分離します。遠心分離するときは、赤血球と白血球の汚染を避けて、サンプルの最上層を吸引します。次に、得られた多血小板血漿を新しい15ミリリットルのチューブに移し、摂氏37度で10分間インキュベートします。多血小板血漿を2,200倍gで12分間遠心分離します。

次に、上清を取り除き、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、ペレットを10ミリリットルのヘパリン1ミリリットルと2.5マイクロリットルの25マイクロモルプロスタサイクリンを含む10ミリリットルのTAバッファーに慎重に再懸濁します。サンプルを摂氏37度で10分間インキュベートします。次に、25マイクロモルのプロスタサイクリンを1ミリリットルあたり2.5マイクロリットル添加し、サンプルを1,900倍gで8分間遠心分離します。

回転後、上清を取り除き、プラスチック製のパスツールピペットを使用して、25マイクロモルのプロスタサイクリンを1ミリリットルあたり2.5マイクロリットルを含む5ミリリットルのTAバッファーにペレットを再懸濁します。血小板を摂氏37度で10分間もう一度インキュベートします。サンプルをインキュベートしている間に、150マイクロリットルの血小板懸濁液を1.5ミリリットルのチューブに移し、自動セルカウンターを使用して血小板をカウントします。

インキュベーション後、25マイクロモルプロスタサイクリンを1ミリリットルあたり2.5マイクロリットルを血小板懸濁液に加え、すぐにサンプルを1,900倍gで8分間