α-ガラクトシダーゼAおよび酸性α-グルコシダーゼ酵素活性のin vitro測定

α-ガラクトシダーゼ A と酸性 α-グルコシダーゼは、細胞代謝に重要なリソソーム酵素です。

α-ガラクトシダーゼAは糖脂質などの基質を分解し、酸性α-グルコシダーゼはグリコーゲンを加水分解します。

それらの酵素活性をin vitroで測定するには、それぞれ既知の濃度のα-ガラクトシダーゼAと酸性α-グルコシダーゼを含むサンプルを含むマルチウェルプレートウェルを採取します。

これらの

酵素の天然基質を模倣するように設計された特定の蛍光基質である合成4-メチルウンベリフェリル基質の酸性溶液をウェルに必要な量に加えます。

暗闇の中でインキュベートします。

α-ガラクトシダーゼAと酸性α-グルコシダーゼ酵素はそれぞれの基質を切断し、蛍光生成物である4-メチルウンベリフェロンを放出します。

アル

カリ性緩衝液を加えて酵素反応を終了させます。

マイクロプレート蛍光リーダーを使用して、ウェル内の4-メチルウンベリフェロンの蛍光強度を測定し、その濃度を示し、それぞれα-ガラクトシダーゼAと酸性α-グルコシダーゼ酵素活性を測定します。

各サンプルの計算量を希釈し、新鮮な1.5ミリリットルの反応チューブにピペットで入れて、溶液1マイクロリットルあたり0.05マイクログラムのα-ガラクトシダーゼAまたは0.5マイクログラムの酸性α-グルコシダーゼを得る。サンプルを再び5秒間渦巻き、この希釈液の10マイクロリットルをピペットでピペットに入れ、96ウェルプレートに複製します。

それぞれの基質溶液を20マイクロリットル加えて反応を開始します。α-ガラクトシダーゼAの場合、2ミリモルの4-メチルウンベリフェリル-α-D-ガラクトピラノシドまたは4-MU-Galを0.06モルリン酸クエン酸緩衝液、pH 4.7に加えます。酸性α-グルコシダーゼの場合は、2ミリモルの4-メチルウンベリフェリル-α-D-グルコピラノシドまたは4-MU-Gluを0.025モル酢酸ナトリウム、pH 4.0に加えます。

酵素反応をオービタルシェーカーで摂氏37度、300RPMの暗所で1時間インキュベートします。次に、200マイクロリットルの1.0モルpH 10.5調整グリシン水酸化ナトリウム緩衝液を加えて反応を終了します。テキストプロトコルに従って、1ミリリットルあたり0.01ミリグラムのストックから4-MUの標準曲線を準備し、10マイクロリットルの溶液を2回に96ウェルプレートにピペットで入れます。

容量とpHを調整するために、200マイクロリットルの1.0モルグリシン水酸化ナトリウム緩衝液を各ウェルに加えます。最後に、適切なフィルターセットを備えた蛍光リーダーで酵素活性を測定し、蛍光リーダーデバイスに適したソフトウェアを使用してデータを分析します。