抗ウイルス化合物のスクリーニングのためのウイルス付着アッセイ

事前に冷却されたヒト肝癌細胞単層を含むマルチウェルプレートから始めます。

ルシフェラーゼ遺伝子を保有する遺伝子組み換えC型肝炎ウイルスと標的化合物の混合物でテストウェルを処理します。ウイルスのみでコントロールウェルを処理します。

テストウェルでは、標的分子がウイルスの糖タンパク質や細胞表面受容体と相互作用し、ウイルスの付着を防ぎます。

しかし、コントロールウェルでは、ウイルス糖タンパク質が細胞表面受容体と相互作用し、それらの付着を可能にします。低温はウイルスの侵入を抑制します。

上清を除去し、培地を導入し、最適な温度で再インキュベートすると、ウイルスの侵入が促進されます。

ウイルス

が侵入すると遺伝物質を放出し、培地に分泌されるウイルスタンパク質とルシフェラーゼ酵素の合成を開始します。

ルシフェラーゼ含有上清を移し、基質を導入します。

酵素と基質の相互作用は、ルシフェラーゼレベルに比例して光を生成します。

対照ウェルと比較して、テストウェルの光強度が低いことは、標的化合物の抗ウイルス特性を示しています。

ウイルス付着アッセイでは、96ウェルプレートにウェルあたり1 x 10⁴細胞をプレートし、細胞付着のために一晩インキュベートします。翌朝、まず、細胞単層を含む96ウェルプレートを摂氏4度で1時間

冷却します。

試験化合物とウイルス混合物を氷上で調製します。たとえば、HCV-CHLA、HCV-1%DMSO、または各処理ウェルに10² FFUウイルスを含むポジティブコントロールHCV-ヘパリン溶液。細胞培養ウェルから培地をそっと吸引します。次に、温度を上げないように注意しながら、すぐに100マイクロリットルのウイルス試験化合物混合物を3回のウェルに加えます。プレートを摂氏4度に保った冷蔵庫で3時間インキュベートします。

ウイルス粒子は摂氏4度で細胞表面に付着しますが、内部化されません。次に、上清を吸引します。200マイクロリットルの氷冷PBSで細胞を2回穏やかに洗浄します。各ウェルに100マイクロリットルの基礎培地を加え、摂氏37度で72時間インキュベートします。最後に、感染細胞から放出されたルシフェラーゼレポーターを定量するために、各サンプルウェルから上清を収集し、ガウスルシフェラーゼアッセイを実行します。