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肝がん細胞を採取し、低温でインキュベートしてエンドサイトーシスを損ないます。
分泌されたルシフェラーゼレポーターをコードする改変されたRNAゲノムを含む組換えC型肝炎ウイルスまたはHCVを導入します。
ウイルスのリポタンパク質は宿主細胞上のプロテオグリカンと相互作用し、ウイルスのエンベロープ糖タンパク質は特定の宿主受容体に結合します。
選択したウェルに、ウイルス糖タンパク質に結合する試験化合物を加えます。
生理学的温度でインキュベートすると、結合したウイルスはエンドサイトーシスされます。
内在化されていないウイルスを廃棄し、増殖培地を加えてインキュベートします。
未処理のウェルでは、糖タンパク質はウイルスエンベロープとエンドソームの融合を助け、ヌクレオカプシドを放出しますが、化合物マスキングは処理されたウェルの融合を損ないます。
放出されると、RNAは細胞外で分泌されるルシフェラーゼを含むウイルスタンパク質を発現します。
ルシフェラーゼ含有上清を採取し、ルシフェラーゼによって酸化されて発光する生物発光基質を加えます。
未処理のウェルと比較して、処理されたウェルの発光の低下は、ウイルスエンベロープとエンドソームの融合の阻害を示しています。
ウイルスの融合と侵入をアッセイするには、細胞付着のために一晩インキュベートした後、細胞培養プレートを摂氏4度で1時間予冷します。ウェルから既存の培地を取り出し、氷上で10〜2番目のFFU HCVで細胞に感染させます。
プレートを摂氏4度で3時間インキュベートします。200マイクロリットルの氷冷PBSで細胞を2回穏やかに洗浄し、付着していないウイルスを除去します。次に、氷上で、基礎培地に溶解した試験化合物または対照として1%DMSOを含む基礎培地で細胞を処理し、プレートを摂氏37度で3時間インキュベートします。これにより、摂氏37度で発生するウイルス侵入に関する試験化合物の評価が可能になります。
培地を吸引し、内在化されていないウイルスを200マイクロリットルのクエン酸緩衝液またはPBSで2回洗浄します。ウェルあたり100マイクロリットルの基礎培地を加え、摂氏37度でさらに72時間インキュベートします。上清を収集し、放出されたルシフェラーゼレポーターを検出するために前に示したようにガウスルシフェラーゼアッセイを実行します。