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$$\longrightharp{xx}$$,
まず
、特定の細菌バイオマーカーに結合すると活性化される触媒DNAであるRNA切断DNA酵素から始めます。
DNAzymeは、その5'末端のビオチンを介してストレプトアビジンでコーティングされた磁気ビーズに結合されています。3'末端では、オリゴヌクレオチド結合ウレアーゼに結合し、機能的な磁気ビーズを形成します。
機能性磁気ビーズを含むチューブに、大腸菌ライセートを追加します。
ライセートからの特定の大腸菌バイオマーカーは、DNA酵素を活性化し、RNA結合の切断を引き起こし、DNA酵素-ウレアーゼ結合体の剥離を引き起こします。
磁気スタンドを使用してビーズを固定し、ビーズに結合したDNA酵素-ウレアーゼ複合体を除去します。
放出されたウレアーゼ含有上清を別のチューブに移します。
pH指示色素(フェノールレッド)と尿素溶液を加えます。
ウレアーゼは尿素をアンモニアと二酸化炭素に加水分解します。
弱塩基であるアンモニアは溶液のpHを上昇させ、色の変化を引き起こし、これは大腸菌バイオマーカーの存在を示します。
テキストプロトコルに従って大腸菌細胞を調製した後、100マイクロリットルのRBを加えてボルテックスして、1.5ミリリットルのマイクロフュージチューブを予備洗浄します。次に、バッファを破棄します。
洗浄したチューブに15マイクロリットルの組み立てたEC1を加え、チューブを磁気ラックに置き、上清を吸引します。ラックからチューブを取り外し、100マイクロリットルのRBを加え、磁気ビーズを慎重に再懸濁します。
RBを使用してビーズをさらに2回洗浄し、RBを取り除いた後、10マイクロリットルの大腸菌サンプルをチューブに加え、チューブを軽くたたいて内容物を穏やかに混合します。次に、反応を室温で1時間インキュベートします。
インキュベーション後、90マイクロリットルの二重蒸留水を加え、チューブを磁気ラックに置きます。約3分間の磁気分離の後、85マイクロリットルの上清を0.5ミリリットルのマイクロフュージチューブに慎重に移します。
磁気ビーズを一切取り上げずに溶液を慎重にピペットでピペットすることが非常に重要です。これらのビーズにはウレアーゼが充填されており、偽陽性シグナルを生成します。
15マイクロリットルの0.04%フェノールレッドと100マイクロリットルの基質溶液を加えます。次に、特定の時間間隔で写真を撮り、色の変化を記録します。