ポックスウイルス感染細胞における翻訳制御を研究するためのルシフェラーゼレポーターアッセイ

ホタルルシフェラーゼ(Fluc)とレニラルシフェラーゼ(Rluc)をコードするレポーターmRNAを含むトランスフェクション複合体を取ります。

Fluc mRNAには5'ポリアデノシン配列、またはポリ(A)リーダーが含まれていますが、Rluc mRNAにはこの配列がありません。

未感染およびポックスウイルスに感染した哺乳類細胞をトランスフェクトしてレポーターmRNAを送達し、インキュベートします。

感染していない細胞では、真核生物の開始因子がmRNAの5'キャップに結合し、続いて小さなリボソームサブユニットと開始剤tRNAが動員します。

小さなサブユニットが開始コドンを見つけると、大きなサブユニットが結合してルシフェラーゼタンパク質を合成します。

感染細胞では、ポックスウイルスを介した小さなサブユニットのリン酸化により、リーダー配列上で直接リボソームの集合が引き起こされ、フルック産生が促進されます。

細胞を溶解してルシフェラーゼを放出します。

酵素が酸化して発光するFluc基質を追加します。プレートリーダーを使用して、発光を測定します。

Rlucに対してこのステップを繰り返して、ウイルス感染細胞におけるRlucと比較したFluc発光の相対的な増加を決定します。

HeLa細胞を24ウェルプレートにシードして翌日80%から90%のコンフルエントを達成し、5%の二酸化炭素を含む摂氏37度のインキュベーターで一晩インキュベートします。HeLa細胞を5の感染倍数でワクシニアウイルスに感染させ、比較のために感染していないHeLa細胞を保持し、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素とともに10〜12時間インキュベートします。感染後必要な時間後、480ナノグラムの12A配列を持つホタルルシフェラーゼmRNAと20ナノグラムのコザック配列を持つレニラルシフェラーゼmRNAを1本の微量遠心チューブに混合します。

別の微量遠心チューブに、1.1マイクロリットルのカチオン性脂質トランスフェクション試薬を加えます。55マイクロリットルの還元血清培地を両方のチューブに加えます。混合し、室温で5分間インキュベートします。次に、還元血清培地を含む55マイクロリットルのカチオン性脂質トランスフェクション試薬をmRNA含有チューブに加えます。ピペットで穏やかに、しかし完全に混合し、室温で15分間インキュベートします。インキュベーション中に、細胞から細胞培養培地を取り出し、ウェルあたり400マイクロリットルの還元血清培地を加えます。

インキュベーションが完了したら、24ウェルプレートのウェルごとに100マイクロリットルの混合物を滴下均一に加えます。12A-FlucおよびKozak-Rluc mRNAによる共トランスフェクションの5時間後、還元血清培地を細胞から除去し、2つのレポーターアッセイを実行