抗生物質の最小阻害濃度を評価するためのマイクロタイタープレート法

連続希釈したアミノグリコシド系抗生物質を含むマイクロタイタープレートを取ります。プレートの1つには、合成薬物であるNTBCが含まれています。

グラム陰性菌である緑膿菌を導入し、インキュベートします。

細菌は、NTBCで処理されていないウェルで保護細胞外色素であるピオメラニンを生成しますが、薬はピオメラニンの生成を防ぎます。

カチオン性抗生物質は、細菌の外膜上の陰イオン性リポ多糖類(LPS)に結合し、カチオン性架橋を置換し、膜を不安定にします。

細菌に入ると、抗生物質は30Sリボソームサブユニットのアミノアシル部位またはA部位に結合します。

結合した抗生物質は、アミノアシル-tRNAの結合とmRNAを横切るリボソームの移動を防ぎ、タンパク質合成を妨害し、細菌の増殖を阻害します。

インキュベーション後、培養物の光学密度を測定して細菌の増殖を評価します。

細菌の増殖を防ぐ最低抗生物質濃度は、最小阻害濃度または MIC です。

NTBC処理ウェルとNTBC未処理ウェルの同様のMIC値は、細菌の抗生物質感受性に対するNTBCの影響がないことを示しています。

MICアッセイの1日前に、2-[2-ニトロ-4-トリフルオロメチル)ベンゾイル]-1-3シクロヘキサンジオンまたはNTBCの有無にかかわらず、LBで試験する菌株の培養物を調製します。このデモンストレーションでは、NTBCの代表的なレベルである300マイクロモルを使用します。NTBCの適切な濃度を決定するための滴定方法は、プロトコルテキストに記載されています。曝気を加えて摂氏37度で一晩培養します。翌日、MICアッセイ用のLBとNTBCおよびLBとDMSOのマスター溶液を作成します。

1つの株に対して1つの抗生物質をテストするには、2ミリリットルのLBに600マイクロモルのNTBCを加え、混合してNTBCマスター溶液を作ります。NTBC は、接種物を添加すると 2 倍に希釈され、最終濃度が 300 マイクロモルになるため、600 マイクロモルの濃度で添加されます。等量の車両DMSOを2ミリリットルのLBに加え、混合してNTBCなしのマスター溶液を作ります。これら 2 つのマスター溶液は、抗生物質ストック溶液の作成、および 96 ウェルプレートでの希釈シリーズの設定に使用されます。

次に、LBとNTBCまたはLBとDMSOマスター溶液で抗生物質溶液を調製します。ゲンタマイシンプラスまたはマイナスNTBCストック溶液を64マイクログラム/ミリリットルで調製します。カナマイシンプラスまたはマイナスのNTBCストック溶液を256マイクログラム/ミリリットルで作ります。トブラマイシンプラスまたはマイナスNTBCストック溶液を8マイクログラム/ミリリットルで調製します。

2X抗生物質溶液を作成したら、各抗生物質溶液100マイクロリットルを列Aの96ウェルプレートの4つのウェルに加えます。たとえば、ゲンタマイシンはA1からA4に入れる必要があります。カナマイシンはA5からA8に入れ、トブラマイシンはA9からA12に入れる必要があります。

50マイクロリットルのLBとNTBCまたはLBとDMSOマスター溶液を96ウェルプレートのB列からHに追加します。1 つのプレートが LB と NTBC で、もう 1 つのプレートが LB と DMSO であることを確認します。マイクロピペットヘッダーを使用して、50マイクロリットルの溶液を行Aから行Bに移すことにより、抗生物質の2倍の連続希釈を実行します。溶液を混合し、ピペットチップを交換し、50マイクロリットルの溶液を行Bから行Cに移します。残りの行について繰り返します。

行Gを希釈した後、その行から50マイクロリットルの溶液を取り除き、廃棄します。細菌増殖の抗生物質を使わないコントロールとしてH列を使用します。一晩の培養物を回収します。培地中に存在するバイオメラニンを除去するためにすべての培養物を洗浄した後、培養物のOD₆₀₀を測定します。LBで一晩培養物を希釈します。

マルチチャンネルマイクロピペットを使用して、希釈した細菌培養物50マイクロリットルを適切なウェルに加えます。菌株と抗生物質濃度ごとに3つのウェルに細菌を追加します。50マイクロリットルのLBを4番目のウェルに追加して、細菌汚染の制御として機能します。96ウェルプレートをパラフィルムで覆い、摂氏37度で約24時間インキュベートします。

翌日、プレートを目視で検査し、ウェル内の細菌の増殖を確認します。MIC は抗生物質の最低濃度であり、各株の 3 回の複製すべてで細菌の増殖は見られません。