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生理学的細胞外マトリックス(ECM)を模倣して、コラーゲンで重ねられたさまざまな剛性のポリアクリルアミドヒドロゲルを含むウェルを取ります。
限局性接着を形成する微小血管内皮細胞、またはFA(細胞とECMの結合を媒介する複合体)を追加して、ヒドロゲルの剛性を感知します。
より硬いヒドロゲルは、より柔らかいヒドロゲルと比較して、細胞骨格成分であるビメンチンの細胞表面発現を上昇させます。
アクチン集合誘導タンパク質(ActA)のプロモーターの下に蛍光タンパク質を発現するように操作されたリステリア菌を追加します。
遠心分離して細菌と宿主細胞との接触を同期させ、インキュベートします。
細菌はビメンチンに結合します。より硬いヒドロゲル結合宿主細胞のビメンチンが多いほど、細菌の付着とエンドサイトーシスが向上します。
抗生物質を加えて、内在化されていない細菌を排除します。
内在化された細菌は毒素を分泌し、エンドソーム膜を破壊します。細胞質エスケープは、ActAプロモーターを活性化して蛍光タンパク質を発現し、細胞内細菌を標識します。
細胞を酵素的に分離します。フローサイトメトリーを使用して、より硬いヒドロゲル上に存在する宿主細胞でより高い蛍光を検出し、細菌の内在化が進んでいることを示します。
テキストプロトコルに従ってL.モノサイトゲネスの一晩培養を調製した後、培養物1ミリリットルを微量遠心チューブに移し、2,000倍gおよび室温で4分間スピンダウンします。組織培養グレードのPBSを使用してペレットを2回洗浄した後、1ミリリットルのPBSを使用してペレットを再懸濁します。
10または50マイクロリットルの細菌懸濁液と1ミリリットルのMCDB-131フル培地を組み合わせて、宿主細胞あたり約50個の細菌または宿主細胞あたり10個の細菌の感染の多様性(MOI)を混合して、感染ミックスを調製します。ヒドロゲルや細胞を破壊しないように注意しながら、24ウェルプレートのウェルから培地を取り出します。1ミリリットルのMCDB-131フル培地を使用して細胞を1回洗浄し、次に1ミリリットルの細菌を各ウェルに加えます。
皿に蓋をし、漏れを防ぐためにポリエチレン製のフードラップで包みます。プレートを2,000倍gで10分間遠心分離して、侵入を同期させます。次に、培養物を摂氏37度で30分間インキュベートします。MCDB-131フル培地を使用して、サンプルを4回洗浄し、組織培養インキュベーターに戻します。さらに30分後、培地をゲンタマイシン1ミリリットルあたり20マイクログラムを添加したMCDB-131フル培地と交換します。
感染後8時間でフローサイトメトリーを実行するには、24ウェルプレートのウェルから培地を取り出し、組織培養PBSを使用してウェルを一度洗浄します。PBSの除去に続いて、200マイクロリットルのトリプシン-EDTA-コラゲナーゼ混合物を各ウェルに加えます。細胞を完全に剥離できるように、皿を組織培養インキュベーターに10分間置きます。
各ウェルを8回穏やかにピペッティングした後、200マイクロリットルのフル培地を加えてトリプシンを中和します。各ウェルから400マイクロリットルの細胞溶液を、35マイクロメートルのセルストレーナーキャップを備えた5ミリリットルのポリスチレンチューブに移します。フローサイトメトリーでサンプルを分析します。