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抗ウイルス薬で処理された感染したブタ角膜から得られたウイルス含有サンプルから始めます。
サンプルを連続希釈して、ウイルス濃度を低下させるシーケンスを作成します。
最適な希釈により、複数のウイルスによる単一細胞感染を防ぎます。
希釈したサンプルを宿主細胞単層に導入し、インキュベートします。
ウイルスは宿主細胞受容体に付着し、細胞に入り、複製を開始します。感染した細胞は溶解し、ビリオンを放出します。
ウイルスを近くの細胞に閉じ込める粘性物質であるメチルセルロースを追加します。
その後、ウイルスは感染領域で細胞死とプラーク形成を引き起こします。
メタノールを加えて細胞を固定します。
クリスタルバイオレットを使用して生細胞を染色します。
プラークは、クリスタルバイオレットで染色された未感染の細胞に囲まれた、感染した細胞と細胞死を示す明確なゾーンとして観察します。
最後に、最高希釈率でプラークの数を数えて、出発溶液中のウイルス力価を定量化し、抗ウイルス薬の有効性を判断します。
各角膜から収集されたウイルスの量を定量化するには、1 x 10-8の希釈に達するまで、微量遠心チューブ内の無血清培地でウイルスのログ10の1倍希釈液を調製します。
細胞の各ウェルから増殖培地を吸引した後、1 x 10-3から始めて、各ウイルス希釈液1ミリリットルをプレーティング細胞単層に移し、感染した細胞を細胞培養インキュベーターに2時間置きます。インキュベーションの最後に、各ウェルをPBSで2回穏やかに洗浄してから、2ミリリットルのメチルセルロースを含んだ培地を各ウェルに加えて72時間のインキュベーション、またはプラークの形成が観察されるまで
。プラークを観察したら、各ウェルの角に1ミリリットルのメタノールをゆっくりと加え、室温で15分間インキュベートします。インキュベーションの最後に、細胞単層を乱すことなく、各ウェルから内容物をゆっくりと吸引します。
次に、各ウェルを1ミリリットルのクリスタルバイオレット作業溶液で標識し、すべての細胞が光から保護された30分間のインキュベーションで覆われるように注意します。インキュベーションの最後に、溶液を廃棄し、吸収紙の上でウェルを乾燥させます。次に、最高希釈ウェルでプラークの数をカウントして、出発溶液中の総ウイルス含有量を3回定量します。