ウイルス感染細胞における多微生物バイオフィルムの開始を決定するためのアッセイ

哺乳類細胞単層を含むマルチウェルプレートを取ります。

単純ヘルペスウイルスによる種子試験井戸コントロールウェルにはウイルスがありません。

ウイルスは細胞表面のヘパラン硫酸に付着し、エンドサイトーシスを介して内在化されます。

ウイルス感染はヘパラナーゼ分泌を引き起こし、ヘパラナーゼは硫酸ヘパランを切断し、特定の真菌受容体の正体を剥がします。

細胞を黄色ブドウ球菌およびカンジダアルビカンス生殖管と共インキュベートします。

ウイルス感染細胞では、ヘパラン硫酸枯渇は細菌の相互作用を阻害しながら真菌受容体の相互作用を促進し、細菌と真菌の共局在を防ぎます。

対照細胞では、細菌はヘパラン硫酸と相互作用し、真菌は利用可能な受容体に結合します。

この微生物の共局在化は、バイオフィルム形成の最初のステップである接着を開始します。

インキュベーション後、結合していない微生物を除去します。溶解バッファーで重ねて、細菌や真菌を培地に放出します。

細胞ライセートを成長培地を含むプレートに広げます。コロニー形成のためにインキュベートします。

細菌コロニーの減少とそれに対応する真菌コロニーの増加は、細菌と真菌の共局在化およびバイオフィルムの開始のウイルス誘発

性阻害を示しています。

多微生物バイオフィルムアッセイを実行するには、200マイクロリットルの2×10の5番目のHeLa細胞を1ミリリットルあたり5番目のHeLa細胞で96ウェルプレートに播種します。プレートを摂氏37度で30〜45分間揺らしてから、摂氏37度の5%二酸化炭素で18時間インキュベートします。単層を洗浄するには、1倍最適を使用します。次に、HSVの単一株で播種します。一度に1つの株のみをテストします。

プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素で3時間インキュベートします。100マイクロリットルの摂氏37度のPBSをマグネシウムとカルシウムとともに使用して、感染した単層を洗浄します。次に、摂氏 37 度の HBSS を使用して PBS を交換します。各ウェルに25マイクロリットルのHBSSを残します。

次に、GTおよび/または黄色ブドウ球菌ワーキング懸濁液を加え、プレートを摂氏37度で5%二酸化炭素中で30分間インキュベートします。インキュベーション後、プレートの1カラムを一度に吸引します。300マイクロリットルのPBSを使用して、マグネシウムとカルシウムをすぐにウェルに補充します。

この洗浄ステップを2回繰り返した後、フィルター滅菌RIPA溶解バッファーの1〜50希釈で200マイクロリットルを各ウェルに加えます。

他の細菌株や真菌を扱う場合は、使用するRIPAの濃度が細胞溶解に十分でありながら、微生物の生存率試験には許容できることを確認してください。

HeLa細胞ライセートを急速に粉砕し、50マイクロリットルをマンニトール塩および/または殺菌培地にピペットで移します。次に、90度の角度に曲げたガラス棒を使用して、ライセートをプレートの表面に広げます。

プレートを18時間インキュベートした後、プレートあたりのコロニー数を手動でカウントします。対照は、黄色ブドウ球菌および/または C. albicans HSV に感染していない HeLa 細胞への付着性で構成されます。