抗生物質治療下での細菌生存率を決定するためのATP利用アッセイ

まず

、細菌培養物をアッセイプレートに播種します。次に、プレートをインキュベートします。

細菌細胞には表面の付着素と線毛があり、それらが互いに付着して小さな凝集体を形成することができます。

さまざまな濃度の抗生物質をウェルに追加し、対照のために1つを未処理のままにします。

抗生物質分子は敏感な細菌と相互作用し、細菌の成長と繁殖能力に影響を与え、死に至ります。

抗生物質耐性菌は代謝活性を維持し、ATP分子を産生します。

超音波処理器を使用して細菌細胞を破壊し、ATPを含む細胞内内容物を放出します。

ルシフェリン、ルシフェラーゼ酵素、その他の補因子を含むATP利用グロー試薬を追加します。

ルシフェラーゼは、ATPと酸素を利用してルシフェリンを励起オキシルシフェリンに変換します。

その後

、オキシルシフェリンは基底状態に移行し、発光を発します。

プレートリーダーを使用して吸光度を測定します。

抗生物質濃度が高いと吸光度が低下することは、ATP 産生の低下を示唆し、細菌の生存率の低下を示しています。

650ナノメートルまたはOD₆₅₀で光学密度を測定して、浮遊細菌の濃度を決定し、GC濃度をミリリットルあたり約1 x 10⁸コロニー形成単位に調整します。次に、99マイクロリットルのGC懸濁液を96ウェルプレートの個々のウェルに加え、細菌を摂氏37度、二酸化炭素5%で6時間凝集させます。

インキュベーションの最後に、1マイクロリットルの連続希釈セフトリアキソンを各ウェルに加え、コントロールとして機能するためにいくつかのウェルを未処理のままにして、プレートをさらに24時間インキュベーターに戻します。翌日、各ウェルの懸濁液を144ワットおよび20キロヘルツで超音波処理ごとに5秒間3回超音波処理し、各ウェルに100マイクロリットルの市販のATP利用グロー試薬を追加します。

各ウェルから150マイクロリットルの混合物を新しい96ウェルブラックマイクロプレートの個々のウェルに慎重に移し、プレートリーダーで560ナノメートルで各ウェルの吸光度を測定します。次に、連続抗生物質治療後に得られた測定値と未処理のウェルからの測定値の比率によって生存率を計算します。