細胞傷害性Tリンパ球応答における免疫優性を評価するためのアッセイ

免疫

原性の異なる非反応性ペプチドエピトープまたは腫瘍抗原由来ペプチドエピトープを提示する蛍光色素標識標的細胞から始めます。

これらの細胞は、それぞれ非反応性、サブドミナント、および免疫優性ペプチドエピトープの提示に対応するさまざまな蛍光強度(低、中、高)を示します。

細胞懸濁液を感作マウスに静脈内投与する。

注入された細胞は、細胞傷害性Tリンパ球またはCTLを含む免疫細胞集団を含む脾臓に移動します。

脾臓内では、CTLは標的細胞のエピトープと相互作用します。

免疫優性エピトープは、より免疫原性が高く、強力な CTL 免疫応答を引き起こし、細胞毒性物質を放出し、高強度の蛍光細胞溶解を引き起こします。

マウスの脾臓を集めて機械的に破壊します。溶解バッファーを加えて赤血球を除去し、懸濁液をろ過します。

細胞ペレットを遠心分離し、再懸濁します。

蛍光活性化セルソーターを使用して細胞を選別します。中強度および低強度の蛍光細胞と比較して、高強度蛍光細胞の減少は、細胞傷害性Tリンパ球応答における免疫優性を確認します。

標的細胞を注入するには、まずソースチューブを穏やかにボルテックスし、3つのCFSE標識細胞懸濁液を同じ比率で新しいチューブにプールします。チューブの内容物に滅菌PBSを補充し、遠心分離して細胞を回収して計数します。次に、容量をレシピエント濃度あたり200マイクロリットルのPBSあたり1 x 10⁷混合標的細胞に調整し、各レシピエントC57-Black-6マウスの尾静脈に200マイクロリットルの細胞懸濁

液を注入します。

注射の2〜4時間後、実証されているように各レシピエント動物の脾臓を除去して処理し、単離された白血球を脾臓あたり3ミリリットルのPBSに再懸濁します。処理された各脾臓から7番目の細胞に約10倍をきれいなFACSチューブに移し、CFSEの低、中、および高標的細胞集団をゲートすることが実証されているように、フローサイトメーター上で細胞を直ちに実行します。

次に、蛍光1チャネルで合計2,000のCFSE低イベントを取得し、本文に詳述されている式に従って、各同族標的細胞集団の特異的溶解を計算します。