Name: IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出 (動画) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-05-01T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 26 s
Description: 学ぶポリエチレングリコール沈殿法による卵黄からのIgY抗体抽出技術。ニワトリ卵黄を用いた簡便で再現性の高い免疫学的研究方法を解説し、長期保存可能な高品質抗体の調製手順を示します。

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この作品は、教育研究のドイツ連邦環境省（プロジェクトBiGRUDI [：R isikobewertung、U ltraschnelle D etektionウント私 dentifizierungフォンbioterroristisch relevanten Agenzien、13N9594のBi ologische G efahrenlagen]）からの助成金によって支えられて。我々は優秀な技術支援のためにB. Diemar（シャリテ- Universitätsmedizinベルリン、研究所こだわりPharmakologieを）感謝。

1。プロトコル - IGY抽出PEG -沈殿による図。 1 IGY -抽出手順の概略図を示します（表2参照）。プロトコルは、最初のポルソンらに記載されていた。 1980年。 すべてのステップは、ラテックスの手袋を使用して実行する必要があります。 <ol><li>卵殻は慎重に割れているし、卵黄はできるだけ白多くの卵として除去するために、"卵黄のスプーン"に転送されます。 </li><li>卵黄をろ紙に移し、残りの卵白を削除するにはロールバックされ、その後、卵黄の皮膚は、ランセットまたは類似の楽器（ピペットチップ）で切断されています。卵黄は、50 mlチューブに注入し、卵の体積は、（V1）に登録されます。 </li><li> PBSで2回の卵黄量が総量の卵黄（ΣV1+ V2）、その後3.5％PEG 6000（グラムでは、微粉炭）と混合されているが追加され、ボルテックス、10分のローリングミキサーで圧延が続いている。抽出手順のそのステップは2段階で、懸濁液を分離します。一つの相は、"卵黄固体と脂肪性物質"（ポルソンらのオリジナルの引用。1980）とIGYと他の蛋白質を含む水の相から構成されています。 </li><li>チューブは4℃で遠心分離している℃で20分（10,000 rpmで13000 × gで、ヘレウスMultifuge 3SR +、固定アングルローターに応じて）のためのC。上清（V3）は、折り畳まれたフィルターを通して注ぎ、新しいチューブに移している。 </li><li>グラム（新しいボリュームに応じて計算）で8.5％PEG 6000は、チューブに加え、ボルテックスし、手順3のようにローリングミキサーにロールバックされます。 </li><li>上清を廃棄していることの違いと手順4を繰り返します。 </li><li>ペレットは、慎重にガラス棒とボルテックスを用いて1mlのPBSに溶解させる。 PBSを10mlの最終容量（V4）に追加されます。溶液を12％のPEG 6000（w / vの、1.2グラム）と混合し、ステップ3（ボルテックス、ローリングミキサー）と同様に扱われます。 </li><li>手順6を繰り返しますし、800μlのPBS（ガラス棒とボルテックス）で慎重にペレットを溶解する。消えるのに空気泡を待って、透析のカプセルへの転送（ピペット）エキス。 400μlのPBSでチューブをリンスし、透析装置（V5）にボリュームを追加します。 （透析装置や膜の調製については付録を参照してください。） </li><li>抽出物を0.1％生理食塩水で一晩透析し（1,600 ml）をゆっくりとマグネチックスターラーにより撹拌する。翌朝は、生理食塩水をPBSで置き換え別の3時間透析されています。 </li><li>その後IGY -エキスをピペットで透析のカプセルから取り出され、2ミリリットルチューブに転送されます。最終容量は2ml（V6）程度である。 </li><li>サンプルのタンパク質含有量（mg / mL）を280 nmの（PBSで希釈1:50）で光学的に測定し、IGYのための1.33の吸光係数とランベルトベールの法則（図2参照）、図に基づいて計算されます。 。 4は、準備の品質（純度と回収率は約80％である）を示しています。 </li><li>それは、° C（​​-70 ° Cでサンプルを凍結していない）-20アリコートでサンプルを保存することをお勧めします。 </li><li> Joveのプロトコルで説明されているように最終的な準備の質は、単純なSDS - PAGEによって分析される<a href="https://www.jove.com/details.php?id=1916">https://www.jove.com/details.php?id=1916</a> </li></ol> 2。透析バッグを使用する前に、付録は、製造業者の推奨に従って、次の方法で準備する必要があります。 <ol><li> 20透析バッグは、30cmの片に切断し、2000mlのガラスビーカーに記載されています。 </li><li> 5mMのEDTA -ソリューションの1750ミリリットルが追加されます。 </li><li>ガラス漏斗は、袋をEDTA溶液でカバーされることを保証するために袋の上に配置されます。溶液を5分間（ホットプレート）加熱し、沸騰させる。ソリューションをデカントし、バッグを蒸留水で3回洗浄する。 </li><li>再び1750ミリリットルEDTA -溶液を加え、5分間煮沸し、上記のように蒸留水で3回洗浄する。 </li><li>最終的に透析バッグを蒸留水で10分間煮沸し、4℃で保存されています滅菌ピンセットを用いて透析バッグを取り出してください。 </li></ol> 3。代表的な結果<img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig1.jpg" alt="図1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図1"> 図1。ポルソンらのオリジナルの記述に従ってポリエチレングリコール沈殿法によるIGY抽出の模式図。 1980年。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig1.jpg">拡大画像を表示するにはここをクリックしてください。</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig2.jpg" alt="図2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図2"> 図2年齢依存性で免疫鶏の卵黄の合計- IgYの開発。合計IGY /卵とSD（n = 4の産卵鶏）の週平均がされ与えられた。 [ポーリーら 2009]から）。 <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig3.jpg" alt="図3" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図3"> 図3。拉乙別の抗原で免疫four鶏のngの容量の監視。矢印は、予防接種の日付を（[ポーリーら 2009]から）を示している。 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/3084/3084largefig3.jpg">こちらをクリックして拡大画像を表示するには。</a> <img src="/files/ftp_upload/3084/3084fig4.jpg" alt="図4" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="図4"> 還元条件下での異なる卵から個々のIGYの準備の図4。ポリアクリルアミド- Gelelectrophoresis レーン1 - 分子量マーカー、レーン2 - IGY - 標準、レーン3-5 - プロトコルに記載したように調製した異なるIGYサンプル。これらはプロトコルの手順10によれば、最終的な製剤である。 HC - 重鎖、LC - 光chaines、？ - 35 kDaの（おそらくビテロゲニンIIの前駆体のC末端フラグメント、[。Klimentzou ら 、2006]）程度の分子量に対応するマイナー不純物。 <table border="1"><tbody><tr><td> </td><td> チキン21（抗原A） </td><td> チキン22（抗原A） </td><td> チキン19（抗原B） </td><td> チキン23（抗原C） </td></tr><tr><td>卵の数（合計IGY）1、2年間の期間</td><td> 625（38グラム） </td><td> 626（38グラム） </td><td> 545（33グラム） </td><td> 608（37グラム） </td></tr><tr><td>卵の数（合計IGY）、初年度</td><td> 345（20g）を</td><td> 304（16グラム） </td><td> 326（18グラム） </td><td> 308（17グラム） </td></tr><tr><td>卵の数（合計IGY）、二年目</td><td> 280（18グラム） </td><td> 322（21グラム） </td><td> 219（15グラム） </td><td> 300（20g）を</td></tr><tr><td> maxの％。可能な卵の数（初年度）2 </td><td> 106 </td><td> 93 </td><td> 100 </td><td> 95 </td></tr><tr><td> maxの％。可能な卵の数（2年） </td><td> 86 </td><td> 99 </td><td> 67 </td><td> 92 </td></tr><tr><td>処理された卵の数</td><td> 565 </td><td> 620 </td><td> 283 </td><td> 401 </td></tr></tbody></table>総IgYの1量は、図2のデータによると卵あたり60 mgのタンパク質の平均値によって卵の数を乗じて計算されます。 2以下 。年間可能な卵の数は、ブリーダーの情報によると325です。 表1。異なる抗原で免疫された鶏の産卵能力の2年間の統計。 （図も参照してください。3）二年の間に異なる抗原だけでなく、IGY -成果による免疫後4鶏の最大のパーセントで容量を敷設、[ポーリーら 2009]）。 <table border="1"><tbody><tr><td> 卵番号nr。 </td><td> ヘン数Nr。日付を敷設 </td><td> V1 [ML]卵黄 </td><td> V2 [ML] PBS </td><td> 1。 PEG PREC。 [G] </td><td> VOL [ML]の後に </td><td> 2。 PEG PREC。 [G] </td><td> ペレット </td><td> 3。 PEG PREC。 [G] </td><td> ペレット </td><td> VOL [ML] </td><td> 総タンパクmg / mlの </td><td> 補正した総タンパクmg / mlの </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td> 2xV1ΣV1+ V2 </td><td> 3,5％[w / vの]ΣV1+ V2 </td><td> precは。、centrif。とろ過のV3 </td><td> 8,5％[w / vの] V3 </td><td> V4 mlのPBSに溶解</td><td> 12パーセント[W / V] V4 </td><td> mlのPBS V5に溶解</td><td> PBS V6に対して透析後、 </td><td> A280/ml </td><td> A280/ml：1.33 </td></tr><tr><td> 1 </td><td> H293 / 22.10。 </td><td> 15 </td><td> 30 45 </td><td> 1.58 </td><td> 31 </td><td> 2.63 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 35.0 </td><td> 26.3 </td></tr><tr><td> 2 </td><td> H293 / 23.10。 </td><td> 13 </td><td> 26 39 </td><td> 1.37 </td><td> 25 </td><td> 2.12 </td><td> 10 </td><td> 1.2 </td><td> 1.2 </td><td> 1.7 </td><td> 28.8 </td><td> 21.6 </td></tr></tbody></table> 表2。PEG沈殿の典型的なプロトコル

<ol><li>Akita, E. M., Nakai, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+four+purification+methods+for+the+production+of+immunoglobulins+from+eggs+laid+by+hens+immunized+with+an+enterotoxigenic+E.+coli+strain%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Comparison of four purification methods for the production of immunoglobulins from eggs laid by hens immunized with an enterotoxigenic E. coli strain.</a> J. Immunol. Methods. 160, 207-214 (1993).</li>
<li>De Meulenaer, B., Huyghebaert, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+purification+of+chicken+egg+yolk+immunoglobulins%3A+a+review%5BTitle%5D)+AND+%22Food+Agricult.+Immunol%22%5BJournal%5D)">Isolation and purification of chicken egg yolk immunoglobulins: a review.</a> Food Agricult. Immunol. 13, 275-288 (2001).</li>
<li>Klimentzou, P., Paravatou-Petsotas, M., Zikos, C. h, Beck, A., Skopeliti, M., Czarnecki, J., Tsitsilonis, O., Voelter, W., Livaniou, E., Evangelatos, G. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+immunochemical+evaluation+of+antibodies+Y+for+the+poorly%2C+immunogenic+polypeptide+prothymosin+alpha%5BTitle%5D)+AND+%22Peptides%22%5BJournal%5D)">Development and immunochemical evaluation of antibodies Y for the poorly, immunogenic polypeptide prothymosin alpha.</a> Peptides. 27, 183-193 (2006).</li>
<li>Pauly, D., Dorner, M., Zhang, X., Hlinak, A., Dorner, B., Schade, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Monitoring+of+laying+capacity%2C+immunoglobulin+Y+concentration%2C+and+antibody+titer+development+in+chickens+immunized+with+ricin+and+botulinum+toxins+over+a+two-year+period%5BTitle%5D)+AND+%22Poultry+Science%22%5BJournal%5D)">Monitoring of laying capacity, immunoglobulin Y concentration, and antibody titer development in chickens immunized with ricin and botulinum toxins over a two-year period.</a> Poultry Science. 88, 281-290 (2009).</li>
<li>Polson, A., von Wechmar, M. B., van Regenmortel, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+viral+IgY+antibodies+from+yolks+of+immunized+hens%5BTitle%5D)+AND+%22Immunol.+Commun%22%5BJournal%5D)">Isolation of viral IgY antibodies from yolks of immunized hens.</a> Immunol. Commun. 9, 475-493 (1980).</li>
<li>Schade, R., Behn, I., Erhard, M., Hlinak, A., Staak, C. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSchade%2C+R+%22Chicken+egg+yolk+antibodies%2C+production+and+application+%3A+IgY-Technology%22">Chicken egg yolk antibodies, production and application : IgY-Technology</a>. , Springer. Berlin. (2001).</li>
<li>Schade, R., Calzado, E. G., Sarmiento, R., Chacana, P. A., Porankiewicz-Asplund, J., Terzolo, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chicken+egg+yolk+antibodies+%28IgY-technology%29%3A+a+review+of+progress+in+production+and+use+in+research+and+human+and+veterinary+medicine%5BTitle%5D)+AND+%22Altern.+Lab+Anim%22%5BJournal%5D)">Chicken egg yolk antibodies (IgY-technology): a review of progress in production and use in research and human and veterinary medicine.</a> Altern. Lab Anim. 33, 129-154 (2005).</li>
<li>Witkowski, P. T., Bourquain, D. R., Hohn, O., Schade, R., Nitsche, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gene+gun-supported+DNA+immunisation+of+chicken+for+straightforward+production+of+poxvirus-specifiv+IgY+antibodies%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Immunol.+Methods%22%5BJournal%5D)">Gene gun-supported DNA immunisation of chicken for straightforward production of poxvirus-specifiv IgY antibodies.</a> J. Immunol. Methods. 341, 146-153 (2009).</li>
</ol>

動物実験はLandesamt毛皮お大事にウントSozialesベルリン（H 0069/03）によって定められたガイドラインおよび規制に準拠して行った。

適切なIGYの精製法の選択は、精製のスケール（実験室または工業用）、費用対効果、技術（実験装置）、および環境への影響（廃棄物管理）の影響を受けています。様々なIGY抽出法は、デMeulenaer＆Huyghebaert（2001年、レビューのためにも、シャーデらを参照してください。2005）によって詳細に検討された。一般的に、これらの方法は3つの主要なグループに分けることができます。 <ol><li> 降水方法：アンモニウムまたは硫酸ナトリウム、ポリエチレングリコール（PEG）、カプリル酸とcaragenean含む。 </li><li> クロマトグラフィー法：アフィニティークロマトグラフィー、イオン交換クロマトグラフィー、疎水性相互作用クロマトグラフィー、thiophylic相互作用クロマトグラフィー、およびゲルろ過クロマトグラフィー。 </li><li> 限外ろ過 。 </li></ol> IGY準備の純度は​​方法の組み合わせによって増加することができます、例えば、PEG沈殿、アフィニティークロマトグラフィーと組み合わせることができます。いくつかの例では、最終的なアプリケーションに応じて、IgYの水抽出物は、良好な結果を（秋田＆中井1993）を達成するの​​に十分です。我々の経験によると、我々はPEG -沈殿により得るIGY -サンプルは、異なる免疫学的アッセイの多くで非常にうまくいった。 PEG -沈殿法を標準化することによって、一つの技術アシスタントは4と7 g当たり週の間に合計IgYの量に相当する週当たり約84卵を、処理することができます。簡単な計算：産卵鶏は、抗原で免疫される。いくつかのブースト予防接種後篇は30日の期間中1:50,000の力価と特異的抗体（AB）を生成します。 30卵X 2ミリリットルIGYエキスは、（プロトコルおよび図3を参照）3000リットルを意味する順番に3000リットルのAB -希釈（バケットの容量が10リットル）に相当する60ミリリットル合計IGY、、に対応抗体の溶液300mlバケットが満たされることができる。そう、このような巨大なAB -量のビューでは、一定の質と特異性の抗体プールを格納するためには問題ありません。この手法は、特に多特異性抗体で観察される電荷​​/ロットばらつきを低減します。 哺乳類の補体系のない活性化、HAMA（ヒト抗マウス抗体）、リウマチ因子やヒトの血液型抗原（heteroagglutininsの欠如）との交差反応性：量の側面にもかかわらず、IGY抗体は、哺乳動物のIgGと比較して、さらに利点があります。 IGY - ABの優れた利点は、いわゆる系統発生の距離です。系統学的距離は、同じ免疫場合でも、哺乳類とニワトリの抗体の特異性の間で頻繁に説明している違いがある理由です。哺乳類と鳥類の免疫系自体の違いに加えて、これら2つの動物クラスの系統発達の違いは、異なる抗体の特異性に寄与する。いくつかの著者は、鶏がしばしばより効率的にウサギが（審査のシャーデらA. 2005を参照）よりも系統発生的に高度に保存された哺乳類タンパク質またはペプチドに対してAbsを生成することが報告されている。結果として、保存された抗原はウサギ免疫システムに&quot;マスク&quot;のまま、そのためだけ弱いまたは&quot;サイレント&quot;応答を引き起こす可能性があります。さらに、非常に頻繁に、鶏やウサギが同じ哺乳類の抗原で免疫されている場合、鶏はほとんどウサギで達成することができるAB -特異性と反応する。抗体は、非侵襲的に卵黄から抽出されるので、また、動物福祉の側面が重要です。組み合わせで遺伝子銃（プラスミド）予防接種でIGY -生産（ウィトコフスキーら 2009）完全に非侵襲的です。 結論では、PEG -沈殿による鶏とIGY抽出における抗体の生産は非常に費用対効果が高く、最大100万分の1まで安定して力価を持つ非常に特異的な抗体の結果です。 鳥類と哺乳類との間の系統発生の距離が原因で、鶏肉は、例えばウサギとは対照的に高度に保存された哺乳類の抗原に対する特異的抗体を生成することができる。 IGY -技術によって得られた抗体の異常な量は、治療的/予防目的のために人間や動物用医薬品でIGY - Abを使用するためにも扉を開きます。

<ol><li> -14 kDの、カールロート社、カールスルーエ、ドイツを遮断バッグVisking、タイプ32分の27を、Dialyse </li><li>ファルコンチューブブルーマックス、50 mlのポリプロピレン製コニカルチューブ、ベクトンディッキンソン実験器具、フランクリンレイクスNY、アメリカ合衆国</li><li>フィルタMN 615は¼、∅150ミリメートル、カールロート社、カールスルーエ、ドイツヘレウスつ折り</li><li>マグネチックスターラー、Variomagモノ、H + P Labortechnik AG、オーバーシュライスハイム、ドイツ</li><li>マイクロDialyse -カプセル5,0 mlのカールロート社、カールスルーエ、ドイツ</li><li> Multifuge 3SR +、サーモサイエンティフィック、ランゲンゼルボルト、ドイツ</li><li>光度計UV - 160A、島津Deutschland GmbHは、デュースブルク、ドイツ</li><li>ポリエチレングリコール6000、Rotipuran薬局方。、カールロート社、カールスルーエ、ドイツ</li><li>予混合PBS -バッファ10倍、ロシュダイアグノスティックス社、マンハイム、ドイツ</li><li>ローラーミキサーSRT2、スチュアート、スタッフォードシャー、イギリス</li><li> Vibrofix VF2、ヤンケ＆クンケル、IKA - Labortechnik、シュタウフェンi.Br.、ドイツ</li><li>卵黄のスプーン、ファッケルマン（housholdの効果）、ドイツ</li></ol>

igy技術：ポリエチレングリコール（peg）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

IgY Technology: Extraction of Chicken Antibodies from Egg Yolk by Polyethylene Glycol (PEG) Precipitation

雌鶏は、IMワクチン接種（ 筋胸筋 、左と右、注入量0.5〜1.0ミリリットル）の手段によってまたは遺伝子銃プラスミド-予防接種による免疫することができる。抗原の免疫原性に依存し、高い抗体価は、（最大1:100,000 - 1:1,000,000）だけか3の後に達成することができます - 4ブースト予防接種を。通常は、鶏はその後産卵能力が低下し、約72週間連続して卵を産む。このプロトコルは、沈殿法の手段（PEG.ポルソンら 1980）で卵黄からの総IgYの抽出を説明します。方法は2つの重要なステップが含まれます。最初のものは、脂質の除去であり、2番目は第一段階の上清からの総IgYの降水量です。バッファ（通常はPBS）に対して透析した後IGY -エキスは一年以上は-20℃で保存することができます。抽出物の純度が80％程度であり、卵当たりの総IGYは、産卵鶏の年齢に依存し、40〜80 mgから変化する。最大80ミリグラム/卵（PEG沈殿に関する）に約40ミリグラム/卵から鶏の年齢と総IGYの含有量が増加する。年間鶏の産卵能力は325卵の周りです。 60mgの合計IGY /卵（表1参照）の平均IGYの内容に基づいて、20グラムの合計IGY /年間の総潜在的な収穫を意味する。

このプロトコルは、ポリエチレングリコール沈殿によって、特に卵黄からの総IgYの抽出を説明し、IGY技術に関する一般的な情報を提供します。

IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

雌鶏への免疫は、筋肉内接種（胸筋、左右、接種量 0.5-1.0 ml）またはジーンガンを用いて行うことができる。

このビデオでは、遺伝子銃、プラスミド、またはより伝統的な筋肉内注射によって免疫させた雌鶏からのIGY抗体の単離について説明します。まず卵黄を単離します。次に脂質を沈殿させ、続いて抗体を含むタンパク質画分を沈殿させ、さらに別の沈殿ステップで抗体を単離します。最後に、抗体をPBSに対して透析します。はい。こんにちは。私はArdです。こちらは同僚のAdemaで、私たちはベルリン・シャーリテ医科大学の非常に歴史があり有名な薬理学研究所で研究しています。以下に、鶏卵からIgYを抽出する方法をご紹介します。これは非常にシンプルで、かつ非常に費用対効果の高い手法であり、いわゆるIgYテクノロジーの一部を構成しています。IgY調製の最初のステップは、卵黄の分離です。本手順では、チューブラック、ブルーキャップフィルターペーパー、ピペットチップ、バッファー、ガラスビーカー、卵黄と卵白を分離するためのスプーン、そしてもちろん卵が必要です。卵を卵黄用スプーンの上で割り、卵白を排出します。その後、卵黄が入ったスプーンを軽く動かし、ほとんどの卵白を取り除きます。その後、卵白タンパク質を可能な限り完全に除去するため、卵黄をろ紙の上に移動させます。卵殻膜は、3ヵ月以上の保存後であっても、1ヵ月以内の卵では非常に安定しています。ろ紙の上で転がす際、老化プロセスによって卵黄膜が破れることがあります。その後、ピペットチップで卵黄膜を開き、チューブに移します。最終的に、卵黄の体積が約15 millilitersであることが確認できます。この体積は成鶏の採卵鶏にとって正常であり、個体差はわずかです。卵黄の量を記録する。IGYを含む卵黄タンパク質を卵黄中の脂質から分離するため、PBSバッファー中で沈殿剤として3.5% Polyethylene glycolを使用する。最終的な卵黄とバッファーの合計容量の3.5%に相当する1.58 gramsのpolyethylene glycolを電子天秤で計量する。15 milliliterの卵黄に2倍量のPBSバッファーを混合させるため、30 millilitersのPBSを加え、最終容量を45 millilitersとする。その後、混合物にpolyethylene glycolを加える。チューブにキャップをし、20～30秒間十分にボルテックスします。ボルテックス操作の間、定期的にチューブを転倒混和させてください。ボルテックス後、卵黄が完全に懸濁している必要があります。次に、チューブをローラーミキサーに載せ、10分間攪拌します。これにより、色が黄色から薄黄色に変化し、均質な混合物となります。次に、混合物を20分間遠心分離します。遠心分離により、IGYおよびその他のタンパク質を含む透明な上清と、主に脂質で構成される黄色の沈殿物とに分離されます。次のステップで、上清を折り畳んだフィルターでろ過し、新しいチューブに移します。新しい容量を記録し、沈殿物を廃棄します。次に、再びポリエチレングリコールを上清に加え、最終濃度を12%にします。これは、1回目の沈殿時の3.5%に、得られたSNAT容量の8.5%を加えることで12%にしたことを意味します。その後、溶液を撹拌し、前と同様にローラーミキサーでインキュベートし、20分間遠心分離します。これにより、ポリエチレングリコールがIGYおよびその他のタンパク質を沈殿させます。この遠心分離ステップの後、ペレットを溶解準備に使用します。ガラス棒を70% ethanolで消毒し、棒を乾燥させている間に、上清を廃棄します。その後、チューブを逆さまにして、残りの上清を切り出します。次に、ペレットに1 mLのPBSを加えます。ボルテックスミキサーで十分に攪拌しながら、ガラス棒を用いてペレットを溶解させます。これにより、溶液がわずかに黄色くなります。次に、PBSを加えて最終容量を10 millilitersとし、続いて、2回目の遠心分離とは対照的に、前述と同様に濃度12%のポリエチレングリコール沈殿を3回目に行います。今回は、20分間の遠心分離後に白色沈殿が得られます。ペレットは前と同様の方法で溶解させますが、2段階に分けて行います。まず、0.8 millilitersのPBSに溶解させ、マイクロダイアリシスカプセルに移します。次に、チューブをさらに0.4 millilitersのPBSで洗浄し、これもカプセルに移します。続いて、消毒したハサミで透析袋を切り、蒸留水で洗浄します。その後、透析袋をカプセルの下部に配置し、上部でしっかりと閉じます。最後に、カプセルをマグネチックスターラー上に置いたガラスビーカーに移します。IGY溶液を0.1% salineに対して一晩透析させます。翌日、IGY溶液をPBSに対して3時間透析します。透析終了後、ピペットチップで透析膜に穴を開け、IGY溶液を取り出して小型チューブに移します。最終容量を記録します。最終生成物は透明な溶液となり、−20 °Cで数年間保存可能です。我々の経験によれば、−70 °Cでは顕著な活性低下が観察されたため、IGY調製物を−70 °Cで保存しないでください。さて、本プロトコルに従えば、IGYの抽出が非常にシンプルで効果的な手順であることがお伝えできたかと思います。必要な設備は最小限であり、手間と効果のバランスは非常に良好であると考えています。このビデオ出版が、私と同様に、皆様が私たちのプロトコルと技術を有効に活用するきっかけとなることを願っています。ありがとうございました。

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特定のゲノム領域に関連する分子の同定は、これらの領域の機能の制御メカニズムを理解するために必要です。このプロトコルは、特定のゲノム領域に関連するタンパク質およびRNAの同定のために、遺伝子操作されたDNA結合分子媒介クロマチンimunoprecipitation(enChIP)を実行する手順を説明しています。...

enChIPによって特定のゲノム領域と関連する分子の同定の単離

細胞内貯蔵からのCa2+放出を媒介するホモ四量体イオンチャネルであるリアノジン受容体のオリゴマー化は、骨格筋と心筋の収縮に重要です。ここでは、タンパク質の自己会合を検出し、ホモオリゴマー化学量論を決定するための補完的なin vivoおよびin...

以下のための遺伝学的および生化学的アプローチ<em&gt;インビボ</em&gt;と<em&gt;インビトロ</em&gt;タンパク質のオリゴマーの評価：リアノジン受容体のケーススタディ

タンデムアフィニティー精製法は、プロテオミクスのための細胞抽出物、主に真核生物から天然複合体を単離するために広く使用されてきました。ここでは、構造研究のための天然複合体の精製に最適化されたTAPメソッドプロトコールを紹介します。...

タンデムアフィニティータグ法を用いた構造解析のためのネイティブ複合体の精製

この方法は、複雑な宿主源から細菌膜、特に黄色ブドウ球菌に外因性脂肪酸を取り込む研究のためのフレームワークを提供する。これを達成するために、鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の濃縮のためのプロトコルと、質量分析を利用した細菌リン脂質のその後の脂肪酸プロファイリングについて説明する。...

細菌病原体脂肪酸を膜リン脂質に取り込む研究のための鶏卵黄からのリポタンパク質粒子の単離

この記事では、鶏卵の外側と内側の膜下層を分離しながら、構造変化を最小限に抑え、プロテオミクス分析のために各サブ層のタンパク質可溶化を最適化する簡単な方法を報告します。...

鶏卵からの外側および内側のペリビテリンサブ層の機械的分離とタンパク質可溶化

抗体のグリコシル化パターンは、その臨床的性能を決定し、したがって、グリコシル化を制御するための産業的および学術的努力は持続する。典型的な糖工学キャンペーンは時間と労力を要するため、一過性サイレンシングを使用してグリコシル化遺伝子の影響を特徴付けるための迅速なプロトコルの生成が有用であることが証明されるであろう。...

チャイニーズハムスター卵巣細胞における迅速な抗体糖工学

このプロトコルは、抗原検出にIgY抗体を使用するアッセイ用のラテックスビーズを調製するための方法論を記載しています。...

卵黄抗体に基づくサイトメトリービーズアッセイの標準化

タンパク質間相互作用は、標的タンパク質の機能解明に重要であり、共免疫沈降(co-IP)によりPPIを容易に確認することができます。エピトープタグ付きタンパク質をコードするプラスミドをHEK-293細胞に一過性にトランスフェクションし、2つの標的タンパク質の結合を簡便に確認できる免疫沈降法を開発しました。...

タンパク質間相互作用を研究するための抗エピトープタグアフィニティーゲルによる免疫沈降(英語)

学ぶポリエチレングリコール沈殿法による卵黄からのIgY抗体抽出技術。ニワトリ卵黄を用いた簡便で再現性の高い免疫学的研究方法を解説し、長期保存可能な高品質抗体の調製手順を示します。

IGY技術：ポリエチレングリコール（PEG）沈殿により卵黄からニワトリ抗体の抽出

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