白血球動員に及ぼす間質細胞の影響に関するIn vitroフロー調査

トランスウェルフィルターを備えたフローシステムに接続された組み立て済みのフローチャンバーを取ります:1つは上部に内皮単培養があり、もう1つは上部に内皮培養があり、下部に間質細胞があります。

両方のチャンバーは、炎症誘発性サイトカインで前処理されています。

単一培養では、サイトカインが内皮細胞を活性化し、接着分子の発現をアップレギュレートします。

しかし、共培養における間質細胞と内皮細胞の間のクロストークは、炎症誘発性サイトカインに対する内皮細胞の応答をダウンレギュレートする調節メディエーターを生成する間質細胞につながります。

チャンバーを逆位相差顕微鏡ステージに配置します。

好中球懸濁液を導入します。

好中球は動員され、一過性の接着相互作用を介して内皮接着分子に結合し、表面結合ケモカインとの相互作用を促進し、内皮に沿って転がります。

この相互作用により好中球上のインテグリンが活性化され、接着が安定し、内皮細胞全体の転生が起こります。

しかし、共培養では、ダウンレギュレートされた内皮応答により、好中球の動員が抑制されます。

位相差顕微鏡下で培養物を視覚化し、流れからの好中球動員を評価します。

フィルターモデルの場合、まずパラフィルムを金属テンプレートを使用して、ガラスカバーガラスと同じサイズにカットします。次に、金属テンプレートを使用してパラフィルムに20×4ミリメートルのスロットを切り取り、流路を作成します。パラフィルムガスケットを使用して、ガラスカバースリップに流路をマークします。6ウェルフィルターの端をガラスカバースリップに合わせます。フィルターが流路のマーキングを覆っていることを確認してください。タイプ10Aメスを使用してフィルターを慎重に切り取ります。

次に、フィルターをパラフィルムガスケットで慎重に覆い、流路スロットがフィルターの中央にあることを確認します。清潔なティッシュを使用し、気泡を押し出します。次に、パースペックスフローチャンバーの底板のくぼみにカバーガラスを置きます。

上部のパースペックスプレートをガスケットの上部に置き、プレートをねじ込みます。三方タップを回して、PBS-A洗浄バッファーがバルブを流れるようにします。次に、圧力計チューブを上部パースペックスプレートの入口ポートに接続します。PBS-Aを流路に通し、気泡を通過させます。

次に、シリンジポンプから圧力計チューブをパースペックスプレートの出口ポートに接続します。チャンバーの上板に滴り落ちたPBS-Aを清掃します。最後に、チャンバーを倒立位相差顕微鏡のステージに置き、焦点を調整してフィルターの上の内皮細胞を視覚化します。

内皮細胞に白血球を灌流するには、シリンジポンプを補充するように設定し、[実行]を押します。内皮細胞単層を視覚化するように焦点を調整したら、2ミリリットルの精製好