0 閲覧数 • 4:19 分 • July 8th, 2025
一定の割合の細胞で老化を誘発する化学療法薬で前処理されたがん細胞を取ります。
これらの細胞は、既知の老化マーカーである自家蛍光リポフスチン顆粒を蓄積します。
細胞に入り、リソソームプロトンポンプを阻害し、リソソーム酸性化を防ぐ抗生物質を追加します。
pHが上昇すると、リソソーム酵素が不活性化されます。
老化細胞は、中性に近いpHでもリソソームβ-ガラクトシダーゼを過剰発現し、老化バイオマーカーとなります。
β-ガラクトシダーゼ基質を導入します。インキュベート。
β-ガラクトシダーゼは、内在化された基質を加水分解して蛍光生成物にし、老化細胞を標識します。
遠心分離して上清を廃棄します。
細胞生存率色素を追加します。生細胞内では、活性エステラーゼが色素を膜不透過性蛍光生成物に変換します。膜の完全性が損なわれた死細胞は染色されないままです。
フローサイトメトリーを使用して、老化細胞を示す二重マーカーのリポフスチンと蛍光β-ガラクトシダーゼ基質を示す
生細胞を検出します。老化細胞の割合を定量化して、薬効を実証します。
まず、DMEM中の1マイクロモルバフィロマイシンAの溶液を1ミリリットルあたり6番目の細胞に1倍の濃度で細胞ペレットに加え、培養細胞サンプルのリソソームpHを調整し、ピペットで混合します。ローテーター上で摂氏37度で低速で30分間インキュベートします。次に、老化関連ベータガラクトシダーゼを染色するために、洗浄せずに10マイクログラム/ミリリットルのDDAOGストック溶液をサンプルに加えます。
直射日光から保護して、回転子の上に60分間置きます。前と同様に、チューブを遠心分離します。上清を取り除き、PBS中の氷冷0.5%BSA1ミリリットルでペレットを洗浄します。次に、300マイクロリットルの希釈カルシンバイオレット450 AM溶液を洗浄した細胞ペレットに加えます。暗闇の中で氷上で15分間インキュベートします。
細胞サンプルをフローサイトメトリー機器対応チューブに移します。データ収集ソフトウェアで、紫色のチャネルヒストグラムと遠赤色チャネルと緑色チャネルのドットプロットを開きます。低速の吸気速度でサイトメーターのデータ取得を開始し、DDAOGで染色したポジティブコントロールサンプルを吸気ポートに置きます。サンプルデータの取得を開始します。チャネル電圧を調整して、イベントの 90% 以上が各プロットに含まれるようにします。
すべての設定が最適になったら、サンプルごとに 10,000 個のイベントを記録します。DDAOGで染色した車両専用のコントロールサンプルを吸気口に置きます。データ収集を開始し、サンプルごとに10,000のイベントを記録します。自家蛍光またはAFおよびDDAOガラクトシドシグナルの増加とポジティブコントロールの比較を探します。サンプルデータを に保存します。FCSファイル形式を作成し、フローサイトメトリー分析ソフトウェアを搭載したワークステーションコンピューターにファイルをエクスポートします。
本研究では、フローサイトメトリーを用いた老化がん細胞の同定について検討します。β-ガラクトシダーゼ基質を用いることで、老化細胞の割合を定量し、化学療法剤の有効性を評価することを目的としています。
フローサイトメトリーを用いて治療誘発性の細胞老化を起こしたがん細胞を定量化することで、細胞レベルでの薬効の堅牢な評価が可能になります。このデュアルマーカーアッセイは、細胞老化を治療エンドポイントとして評価する初期探索チームに予測的な信頼性を提供します。定量的な細胞老化検出を統合することは、オンコロジーパイプラインにおけるリスク調整後のポートフォリオ決定およびメカニズム的なリスク低減を支援します。
このフローサイトメトリーを用いたアッセイは、初期探索から前臨床検証までのプロセスに適合し、薬力学的エンドポイントとしての細胞老化の定量的な評価を可能にします。
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最終更新:29 8月 2026