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増殖培地中の細菌を含むウェル、または胆汁酸塩を添加した増殖培地中の細菌を含む平底マルチウェルプレートを取ります。
胆汁酸塩はストレスを誘発し、細胞の損傷を引き起こし、DNAとタンパク質を放出します。これらの生体分子は井戸の底をコーティングし、生き残った細菌が固体表面に付着できるようにします。
付着した細菌は増殖してマイクロコロニーを形成し、自己誘導物質、つまり化学シグナル伝達分子を生成して細菌のコミュニケーションを可能にします。
このコミュニケーションにより、細菌がコロニーを形成し、細胞外高分子物質または EPS の生成を開始し、バイオフィルムが生成されます。
インキュベーション後、培地を取り除き、浮遊細菌を除去します。
細菌細胞壁のペプチドグリカンと相互作用するクリスタルバイオレット染色剤を導入し、紫色にします。
余分な汚れを取り除き、乾かします。エタノールを重ねて細菌の細胞壁からクリスタルバイオレットを可溶化し、溶液の色を変えます。
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処理のウェルよりも胆汁塩処理されたウェルの方が濃い着色は、固相付着によるバイオフィルムの形成を確認します。
まず、2本の1.5ミリリットルチューブにTSBとTSBプラスBSのラベルを付けます。次に、1ミリリットルのTSBまたはTSBとBSをそれぞれのチューブに加えます。
次に、チューブに20マイクロリットルの一晩培養液を1:50の希釈で接種します。次に、130マイクロリットルの未接種対照培地を、無菌で透明で平底の組織培養処理済みの96ウェルプレート内の3つのウェルのそれぞれに加えます。これが空白のコントロールになります。
130マイクロリットルの接種培養物を3つのウェルのそれぞれに加えます。コントロールと接種した培養物をそれぞれのウェルに加えた後、96ウェルプレートを摂氏37度で4〜24時間静的にインキュベートします。インキュベーションが終了したら、プレートリーダーでコントロールウェルをブランクに設定します。
次に、各ウェルから培地を吸引します。次に、200マイクロリットルの滅菌PBSでウェルを1回穏やかに洗浄します。洗浄後、PBSを吸引し、プレートを反転させて約20分間乾燥させます。
EPS マトリックスが乱れないように、メディアを穏やかに除去し、穏やかに洗浄することが非常に重要です。
次に、150マイクロリットルの0.5%クリスタルバイオレットを実験ウェルとコントロールウェルのそれぞれに加えます。次に、プレートを室温で5分間インキュベートします。5分後、400マイクロリットルの蒸留水でウェルを一度洗います。200マイクロリットルの蒸留水を加えて、井戸を5回洗浄します。5回の洗浄が終わったら、プレートを裏返し、光から保護して完全に乾かします。
一貫した結果を得るには、サンプルを完全に乾燥させてから作業を進めることが重要です。
プレートが完全に乾燥したら、200マイクロリットルの95%エタノールを使用してウェルを脱色します。次に、蒸発を避けるために、プレートを摂氏 30 度で 4 分間シェーカーの上に置きます。30分後、プレートリーダーにOD540
を記録します。