EPSマトリックス検出による胆汁酸塩誘導バイオフィルム形成の研究アッセイ

増殖培地中に病原性腸内細菌を含むマルチウェルプレートを取ります。

選択されたウェルの培地には、過酷な成長条件を模倣した胆汁酸塩(または界面活性剤のような活性を持つ両親媒性分子)が含まれています。

胆汁酸塩は細菌の膜を破壊し、DNAやタンパク質に損傷を与えます。

対抗メカニズムとして、細菌はバイオフィルム(微生物由来の多糖類、タンパク質、脂質、核酸を含む細胞外高分子物質(EPS)の自己生成マトリックスに包まれた構造化された細菌群集を形成します。

EPS層は、細菌を胆汁酸塩への曝露から守ります。

インキュベーション後、培地を吸引して自由浮遊細菌を除去します。

バイオフィルムの構造を維持するために固定バッファーで処理し、余分なバッファーを除去するために洗浄します。

蛍光標識されたコンカナバリンA(EPS多糖類に結合し、バイオフィルムを標識するレクチン)を追加します。余分なコンカナバリンAを取り除くために洗浄します。

プレートリーダーを使用して、蛍光を測定します。胆汁塩含有ウェルの蛍光強度が高いほど、胆汁塩によるバイオフィルム形成を示します。

EPSの半定量的検出には、マルチチャンネルピペットを使用して培地を透明な96ウェルプレートに移します。次に、200マイクロリットルの固定試薬を使用して、黒いプレートを室温で15分間固定します。次に、標準化のためにコントロールをブランクに設定してOD600の読み取り値を記録します。次に、接着集団が固定されている間に培地の読み取りを記録します。

固定が完了したら、試薬を取り出し、有害廃棄物として廃棄します。次に、200マイクロリットルの滅菌PBSを使用して、ウェルを2回優しく洗浄します。洗浄後、PBSを吸引します。次に、ConA-FITCのミリリットルあたり25マイクログラムの150マイクロリットルを追加します。プレートを室温で15分間インキュベートします。インキュベーション後、ウェルを200マイクロリットルのPBSで優しく洗浄します。次に、各ウェルに150マイクロリットルのPBSを加え、488ナノメートルで蛍光を記録します。