菌糸上のバイオフィルム形成細菌を可視化するための試料調製法

セロハン結合真菌コロニーを蛍光標識細菌懸濁液に導入します。セロハンを取り除き、インキュベートします。

細菌細胞は、表面分子と受容体を介して真菌表面に付着します。付着した細菌は、多糖類、タンパク質、DNAからなる細胞外高分子物質を分泌し、細菌細胞を閉じ込め、バイオフィルムの構造基盤を形成します。

を強い塩溶液ですすぎ、緩く結合した細菌を除去

酸緩衝液で、コロニーの一部を切り取ります。

片を小麦胚芽凝集素を含む滅菌水、または赤色蛍光色素に結合したWGAに移します。

植物タンパク質であるWGAは、N-アセチルグルコサミンとシアル酸残基に結合し、付着した色素が真菌の細胞壁で蛍光を発します。

をリン酸緩衝液ですすぎます。

スライドをバッファーに部分的に浸します。その上にセクションを浮かべます。バイオフィルムを破壊することなくセクションが落ち着くように、ゆっくりと持ち上げます。

封入剤を置き、続いて顕微鏡分析用のカバーガラスを置きます。

細菌を一晩増殖させた後、培養物を5,000倍gで3分間遠心分離し、ペレットを25ミリリットルの滅菌0.1モルリン酸カリウム緩衝液に懸濁します。遠心分離を繰り返した後、同じバッファーを使用して、最終的な細菌濃度を1ミリリットルあたり10〜9番目の細胞に調整します。

6ウェルマイクロプレートに5ミリリットルの細菌懸濁液を入れます。滅菌カミソリの刃を使用して、真菌培養物のセロハン膜を正方形に切断し、各膜に単一のコロニーを配置します。次に鉗子で、菌糸を含むセロハンの正方形を固体培地から慎重に取り除き、それらを細菌懸濁液の個々のウェルに移します。

真菌コロニーがセロハンから剥がれるまで、マイクロプレートをそっと振ってください。次に、プレートに真菌コロニーを残したままのセロハンシートを取り除きます。使用する菌株と分析する段階に応じて、マイクロプレートを摂氏20度で穏やかに攪拌しながらしばらくインキュベートします。

. fluorescens BBc6/L. bicolorの場合、培養物を30分間インキュベートして初期段階のバイオフィルムを取得し、成熟したバイオフィルムを得るために最大16時間インキュベートします。プランクトン菌や菌糸に静電的に付着した細菌を除去するには、強塩溶液で満たされた新しい6ウェルマイクロプレートに移して真菌をすすぎます。プレートを1分間軽く振ってください。

真菌を、5ミリリットルの滅菌0.1モルリン酸カリウムバッファーを含む新しい6ウェルマイクロプレートに移します。プレートを2分間軽く振ってから、真菌を新鮮なバッファーに移します。

真菌コロニーを緩衝内に保ちながら、メスを使用してコロニーを約半分に切ります。染色するコロニーの半分を、Alexa Fluor633に結合した小麦胚芽凝集素などの真菌ネットワークを視覚化するために、適切な蛍光色素を添加した1ミリリットルの滅菌水を含むペトリ皿に移します。次に、サンプルを暗所でインキュベートします。

染色後、サンプルを10ミリリットルの滅菌0.1モルリン酸カリウム緩衝液を含むペトリ皿の蓋に移してすすぎ、1分間穏やかに振とうします。スライドをペトリ皿の蓋に半分沈め、カット部分をスライドの上に浮かべるように繊細に配置します。次に、緩衝液から側面をゆっくりと持ち上げて、サンプルをスライドに穏やかに沈殿させます。

最もデリケートな側面は、スライド上のサンプルの位置です。バイオフィルムの破壊を避けるために、サンプルの位置決め中にサンプルとスライドを浸す必要があり、イメージング前にサンプルを動かさないでください。

最後に、10マイクロリットルの退色防止封入剤をサンプルに加え、ガラスカバーガラスで覆います。