タウシード誘導レポータータンパク質凝集を検出するためのFRETフローサイトメトリー技術

微小管結合タンパク質タウのリピートドメインを発現する哺乳類細胞培養物を取ります。

これらの細胞質タウレポーターは凝集しやすい変異を持ち、モノマーとして存在します。

レポーターは蛍光色素AまたはBのいずれかに融合され、前者の発光スペクトルは後者の吸収スペクトルと重なります。

タウシードまたは完全長タウの線維状凝集体と複合体化したリポソームを追加します。

細胞に入ると、リポソームは細胞質内の種子を放出します。

放出されたシードはタウレポーターの凝集を媒介し、蛍光色素Aを蛍光色素Bに近づけます。

トリプシンを加えて細胞を剥離し、固定を行います。

フローサイトメーターを使用して細胞を分析します。

凝集体内が近接しているため、励起時に双極子間相互作用を介した蛍光色素AからBへのエネルギー移動は、蛍光共鳴エネルギー移動またはFRETと呼ばれます。

励起された蛍光色素BはFRETシグナルを放出し、その存在はタンパク質凝集を示します。

無菌条件下でバイオセンサー細胞を再プレートするには、各細胞株を温かいPBSですすぎ、続いてトリプシン-EDTAと3分間インキュベートします。細胞が剥がれたら、温めた培地で反応を止め、すぐに細胞を円錐形のチューブに移します。

細胞を遠心分離し、ペレットを新鮮な培地に再懸濁します。次に、細胞を数え、培地13ミリリットルあたり3,500,000細胞のマスターミックス細胞希釈液を作成します。マルチチャンネルピペットを使用して、130マイクロリットルの細胞を平底組織培養処理された96ウェルプレートの各ウェルにゆっくりと移し、ピペットチップをプレートの底に触れずにウェルの中央に配置するように注意します。

細胞をプレーティングしたら、室温で10分間邪魔されずに沈殿させた後、プレートを摂氏37度、二酸化炭素5%、相対湿度80%以上で一晩インキュベートします。翌日、バイオセンサー細胞が60%から65%コンフルエントになったら、還元血清培地、リポソーム試薬、および生物学的種子源を組み合わせて形質導入複合体を作成します。

次に、20マイクロリットルの形質導入複合体を個々のバイオセンサーウェルの側面にそっとピペットで移動させ、処理した細胞をさらに24〜48時間インキュベーターに戻します。採取前に、未処理の細胞は拡散蛍光のみを示します。ただし、タウシード材料で処理された細胞は、1〜2日後に明るい凝集体を示します。

細胞を採取するには、細胞培養培地を50マイクロリットルのトリプシン-EDTAと交換し、150マイクロリットルの冷却培地で5分後に反応を停止します。すぐに、細胞を96ウェルの丸底プレートに移し、細胞をペレット化します。ペレットを乱すことなく上清を吸引し、細胞を50マイクロリットルの2%パラホルムアルデヒドに10分間穏やかに、しかし完全に再懸濁します。次に、細胞