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テスト毒素の濃度を上げて神経細胞培養を処理します。
毒素は細胞に入り、細胞質ゾルに放出されます。
その可能性に応じて、毒素は小胞融合を妨げ、神経伝達物質の放出を阻害する可能性があります。
培地を特定の神経薬理学的化合物を含むバッファーに置き換えて、ニューロンの活動電位をブロックします。
培養皿を電気生理学ステージに置きます。記録を開始するには、ニューロン体細胞を記録電極を含むピペットに接続します。
安定した負圧を加えて小さな膜部分を吸引し、記録中の干渉を最小限に抑えるタイトなシールであるギガシールを形成します。
神経電流を測定するために一定の膜電圧を維持します。
負圧パルスを印加して膜を破裂させ、ニューロンとピペットの間に直接接触を確立します。
mEPSCと呼ばれる神経伝達物質の取り込みによりニューロンで生成される電流を記録します。
毒素曝露の増加に伴う mEPSC 頻度の低下は、神経伝達物質の放出の阻害を示しています。
ボツリヌス神経毒血清型AをESN培地で所望の最終濃度の100倍に希釈し、摂氏37度に温めます。次に、DIV 21+ ESN培養物に適切な量の毒素を追加します。培養皿を回し、インキュベーターに戻します。
所望の時点で、ESN培地を吸引し、細胞外記録バッファーまたはERBで2回洗浄します。次に、活動電位をブロックするために5マイクロモルのテトロドトキシンを添加した4ミリリットルのERBと、GABAA受容体活性に拮抗するために10マイクロモルのビククリンを添加します。次に、皿を電気生理学リグに移します。シナプス伝達の阻害の測定やMISTアッセイには、灌流も温度制御も必要ありません。
マイクロピペットプーラーを使用して5〜10メガオームの抵抗でホウケイ酸ピペットを引っ張った後、ピペットに細胞内記録バッファーを埋め戻します。次に、ピペットをシリコン化試薬にそっと浸します。記録ピペットを電極ホルダーに固定し、空気で満たされたシリンジを電極ホルダーにポートされたチューブに取り付けます。記録ピペットをERBに下げながら、シリンジを介して安定した陽圧を提供します。
記録ピペットを記録するニューロンの体細胞にそっと着地させた後、注射器のシールを破って陽圧をつかみます。シリンジを再接続し、穏やかな吸気によって持続的な負圧を加え、ギガオームのシールを形成します。ギガオームシールが形成されたら、保持電圧をマイナス70ミリボルトまで下げ、シリンジを使用して負圧の短いパルスを慎重に適用し、卸売構成に分割します。
静電容量のスパイクを 30 秒間監視して、パッチが安定していることを確認します。ハッカーソフトウェアの静電容量スパイクをキャンセルし、電流クランプモードに切り替えて、静止膜電位を監視および記録します。液体接合電位を調整しない場合、静止膜電位はマイナス 67 ミリボルトからマイナス 82 ミリボルトの間であるはずです。
ゲインをピコアンペアあたり2ミリボルトに調整します。電圧クランプモードに切り替え、連続マイナス70ミリボルトを実行し、3〜5分間記録して、ミニチュア興奮性シナプス後電流を検出します。
3〜5分間の記録データを解析し、ミニ解析でAMPA受容体EPSCのデフォルト設定を使用してMEPSCを検出します。検出されたイベントに関する情報を収集して保存します。曝露条件ごとに8〜12の対照および8〜12のボツリヌス神経毒処理サンプルのmEPSC頻度を収集した後、年齢およびロットが一致した対照に対して頻度を分析します。