ミクログリアによるタウタンパク質の取り込みを評価するための細胞ベースのアッセイ

着したマウスミクログリア(脳内の食細胞)を含む平底マルチウェルプレートから始めます。

免疫複合体を含む無血清培地を導入します。これらの複合体は、特定の神経変性疾患中に形成されるリン酸化タウタンパク質凝集体に結合した抗体で構成されています。

タウ凝集体は、pH感受性の緑色蛍光色素で標識されています。

インキュベーション中、これらの免疫複合体はミクログリア細胞のFc受容体と相互作用し、ミクログリア細胞の飲み込みを促進します。

この免疫複合体を含むエンドソームはリソソームと融合し、エンドリソソームを形成します。エンドリソソームの酸性環境により、色素分子が蛍光を発します。

洗浄して、内在化されていない免疫複合体を除去します。

トリプシン-EDTA溶液で処理して細胞を剥離します。

細胞懸濁液を氷上に配置されたU底プレートに移し、エンドリソソームを安定させます。細胞をペレット化し、上清を廃棄します。

細胞を洗浄し、FACSバッファーで再懸濁します。

FACSを使用して、単一の生細胞を同定し、緑色の蛍光強度を定量化して、ミクログリアによるタウの取り込みを評価します。

実験の初日に、BV-2細胞を培養したフラスコで1x PBSで洗浄して調製します。次に、0.05%トリプシンEDTAを摂氏37度および5%CO₂でフラスコから剥がれるまでインキュベートします。細胞を培地に再懸濁し、上下に3〜5回ピペッティングします。

細胞をカウントし、200マイクログラム/ミリリットルのヘパリンを含む培地で最終濃度100,000細胞/ミリリットルの細胞懸濁液を調製します。96ウェル組織培養平底プレートにウェルあたり250マイクロリットルのこの細胞懸濁液を加えます。プレートを摂氏37度で5%CO₂で一晩インキュベートします。

以前に調製したpH色素タウ凝集体を氷上で解凍した後、無血清培地の条件ごとに65マイクロリットルで希釈して、500ナノモルの溶液を作ります。抗体を65マイクロリットルの無血清培地で希釈して、所望の濃度の2倍にします。pH色素タウ凝集体と抗体を96ウェルUボトムプレートで混合します。この希釈プレートを密封し、摂氏37度で一晩インキュベートします。

翌日、BV-2細胞を含む96ウェルプレートから培地を取り出します。各ウェルの細胞を100マイクロリットルの室温1x PBSで洗浄します。BV-2細胞プレートからPBSを除去します。マルチチャンネルピペットを使用して、125マイクロリットルの免疫複合体を希釈プレートから96ウェルBV-2細胞プレートの各ウェルに移し、摂氏37度で5%CO₂で2時間インキュベートします。

インキュベーション後、細胞から免疫複合体を取り除き、各ウェル内の細胞を100マイクロリットルの室温1x PBSで洗浄します。1x PBSを除去した後、50マイクロリットルの0.25%トリプシン-EDTAを加え、5%CO₂で摂氏37度で20分間インキュベートします。その後、200マイクロリットルの培養培地を加え、上下にピペッティングしてウェルを再懸濁し、細胞を切り離します。

細胞を96ウェルUボトムプレートに移し、摂氏4度で5分間400倍gで遠心分離します。プレートを氷の上に置き、培地を取り除きます。150マイクロリットルの氷冷1x PBSを加え、摂氏4度で5分間400 gで再度遠心分離します。プレートを氷の上に置き、以前に添加した1x PBSを取り除き、ウェルあたり150マイクロリットルの氷冷PBSを加えて再度洗浄します。同じ条件下で再度遠心分離します。

プレートを氷の上に置き、以前に添加したPBSを除去し、ウェルあたり150マイクロリットルのFACSバッファーを加えて細胞を洗浄します。再び400gで摂氏4度で5分間遠心分離します。プレートを氷の上に置き、以前に追加したFACSバッファーを取り除き、ウェルあたり200マイクロリットルのFACSバッファーに細胞を再懸濁します。直ちにFACSによる解析に進み、生細胞ゲートで20,000イベントを取得します。