相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

以下の一連の実験の全体的な目的は、細胞核の界面における機械的特性、および周囲の細胞骨格との物理的な結合を測定することである。これは、透明なシリコン膜上に播種した細胞に機械的な歪みを加え、誘起された核の変形をイメージングすることで達成される。核の変形が増大することは核の剛性の低下に対応するが、核と細胞骨格のカップリングの変化もまた、誘起される核の変形に影響を及ぼし得る。

細胞骨格に局所的な歪みを加えることで、細胞骨格と核の間の細胞内力伝達を直接的に調査します。次に、蛍光標識した核および細胞骨格構造の変位をイメージングします。これにより、周囲の細胞骨格に対する細胞核の剛性を示す結果が得られます。

基質歪み実験に基づくと、マイクロニードル操作アッセイにより、核と細胞骨格のカップリングの破壊が細胞内力伝達の欠損を引き起こすことが明らかになります。単離核のマイクロピペット吸引などの既存の手法に対するこれらの技術の主な利点は、正常な細胞構造を乱すことなく、生存した完全な細胞における核力学の測定を可能にすることです。これらの手法は、核膜組成の変化が核の機械的特性にどのように影響を与えるかについての知見を提供できます。

これらは、LAニューロパチーや癌などの疾患における核力学の役割を研究するためにも適用可能です。各ストレインディッシュは、直径3インチの特製底なしプラスチックディッシュと、細胞培養基質となるシリコンメンブレンを固定するためのプラスチック製Oリングで構成されています。ストレインディッシュを準備するには、4インチ×4インチのシリコンメンブレンをOリングとディッシュの間に挟み込み、余分なメンブレンを慎重に切り取り、ストレインディッシュを脱イオン水で洗浄し、オートクレーブで滅菌します。その後、シリコンメンブレンを細胞外マトリックス分子でコーティングし、メンブレン外側の底面中央に基準点をマークします。

このランドマークは、一軸方向への歪みを加える歪み実験において、同一の細胞を特定するのに役立ちます。参照点の周囲にスコッチテープを2本の平行なストライプ状に貼り、膜の形成を1次元に制限します。細胞を最適に接着させるため、シリコン膜を3 $\mu\text{g}/\text{mL}$のフィブロネクチンまたは適切な細胞外マトリックスタンパク質でコーティングします。

ストレインディッシュを逆さまにした10 centimeterのポリスチレン製ディッシュで覆い、4 °Cで一晩インキュベートし、翌日に取り出します。膜をPBSで1回洗浄し、過剰なタンパク質を除去します。ディッシュに10 millilitersの増殖培地を満たし、置いておきます。

コーティング済みのシリコンメンブレンディッシュを準備したら、0.05% trypsinを用いて細胞を剥離させ、成長培地を用いて接着細胞をディッシュ上に播種します。この手順はマウス胚細胞を用いて実演します。

線維芽細胞または間葉系細胞を、通常の培養条件下で24〜48時間インキュベートします。基質伸展実験用に整備された倒立顕微鏡には、顕微鏡ステージに適合するベースプレートで構成される伸展装置が備わっています。このプレートは中央の円筒形プラチンを保持しており、これがシリコンメンブレンの中央部分に伸展を加える役割を果たします。

この装置には、ストレインディッシュを保持し、4本のガイドピンに沿って上下にスライドさせることができる可動プレートと、負荷をかけるための5ポンドの重りが備わっています。核を可視化するには、ストレインディッシュ内の細胞を、1 µg/mLのHoechst染色液を用いて37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引し、25 mM HEPESを含むフェノールレッドフリーの増殖培地15 mLに交換します。

次に、ディッシュをディッシュホルダーにねじ込み、シリコンメンブレンが中央のプラチナ板に沿ってスムーズに滑るように、メンブレン底面の周囲に慎重にグリースを塗布します。このとき、メンブレンの中央部分は汚れないようにしてください。ベースプレートを顕微鏡のステージプレートに置き、ディッシュホルダーをベースプレートに慎重に装着します。

初期の静止状態で、ストレインディッシュのシリコンメンブレンが中央のプラチンに軽く接触していることを確認します。次に、シリコンメンブレンの底部に焦点を合わせ、中央にある黒いリファレンスドットを探します。このドットはすべての画像取得の開始点となり、ストレッチ中およびストレッチ後の同一細胞の特定に役立ちます。

この画像では、中央の点が視野全体を占めています。点の境界から始めて焦点を調整し、細胞とシリコンメンブレンの上端を可視化させます。核が中央に位置し、十分に広がった細胞を探してください。

細胞の輪郭とシリコンメンブレンに焦点を合わせて、位相差像を取得します。次に、核の中央平面に焦点を合わせて、核のフック染色（nu nuclear hook stain）の蛍光像を取得します。5〜15個の細胞の画像を撮影した後、中心点に戻ります。

荷重を徐々に加え、ストレインディッシュに均一な歪みを発生させます。ディッシュの中央に荷重をかけます。基材に印加される最大歪みは、垂直アライメントピンに配置されたナイロンスペーサーによって制限されます。歪みの印加後、シリコンメンブレンの底部に焦点を合わせ、再びリファレンスドットを確認し、そのドットを起点とします。

同一の細胞を再び移動させ、完全伸展状態にある各細胞の核の位相差画像および蛍光画像を取得します。この際、最初の画像の焦点面とできるだけ一致させるようにしてください。細胞が不自然な基質に対して能動的な再構成や適応を起こさないよう、この工程は10分以内に完了させてください。すべての対応する画像を取得した後、顕微鏡ステージを開始点に戻します。

ディッシュホルダープレートからウェイトを慎重に取り除き、必要に応じてシリコンメンブレンを弛緩させます。ストレインディッシュを、初期位置にくるまでゆっくりと押し上げます。その後、位相差像および蛍光像を取得します。

歪み付加後の細胞画像（歪み画像の記述と同様）および、歪み付加前・付加中・付加後の細胞と蛍光標識された核の画像を解析し、正規化された核歪みを算出します。本デモンストレーションでは、解析にカスタム作成したMATLABスクリプトを使用していますが、手動で基板歪みを計算する代替案もいくつかあります。歪み付加前の画像と歪み付加後の対応する画像の間で、膜上に配置された3〜6箇所のコントロールポイントの位置を照合します。その後、MATLABプログラムが歪み付加前と完全歪み付加後の画像間で一致するコントロールポイントの位置を比較し、印加された膜歪みを算出します。

また、トレーニング前とストレイン後の画像間で、残留ひずみの位置比較も行います。コントロールポイントを用いて画像ペアのレジストレーションを同時に行うことで、損傷した細胞や剥離した細胞の検出に役立てます。次に、個々の核の核ひずみを算出する別のMATLABプログラムを使用して、核を手動で選択します。

これは、歪み付加前後の対応する蛍光画像間で核のサイズを合わせるか、あるいは核内マーカーを照合することで、異なる実験間での膜歪みの適用量のわずかな変動を補正することによって達成されます。結果は正規化核歪みとして表されます。これは、各核について算出された、誘発された核歪みに対する適用された膜歪みの比として定義されます。

MATLABスクリプトは、依頼に応じてlambing研究室から入手可能です。最終ステップとして、各核の検証を行い、歪みの印加中に剥離または損傷した細胞からの測定値は除外します。シリコンメンブレン上の2つの異なる領域に広がったMEFを、20%の単軸歪みの印加前、印加中、および印加後に位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡で撮影しました。ここに示したのは、損傷や剥離なく歪みの印加を生き延びた細胞から得られた、有効な核を持つ実験成功例です。

対照的に、ここに示されている細胞は、歪みの印加中に収縮または部分的に剥離したため、解析から除外されています。左側の細胞は細胞骨格の損傷と核の崩壊の兆候を示しており、右側の細胞は歪みの印加中に部分的に剥離し、収縮しています。これは過剰な歪みが加わったことを示す可能性があります。

ここでは、Lamin A/C欠損マウスのさまざまなmeth細胞株における正規化核歪みの解析結果を示します。これらの細胞は、野生型リターメイト由来のmeth細胞と比較して、空ベクトルまたは野生型lamin Aを異所的に発現させています。核膜タンパク質であるLamin A/Cの発現喪失は、正規化核歪みの増加をもたらします。これは核の剛性の低下を示しており、野生型Lamin Aを再導入することで部分的または完全に回復させることができます。マイクロニードル操作実験の準備として、35 mmガラスボトム細胞培養ディッシュを低濃度のフィブロネクチンで37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、ディッシュをHBSSで2回洗浄し、2 mLの増殖培地をディッシュに加えます。

次に、マウス胚性線維芽細胞を0.05% trypsinでトリプシン処理し、2 mLの増殖培地を用いてフィブロネクチンコーティングしたガラスボトムディッシュに播種します。単一の接着性で非コンフルエントな細胞を得るため、細胞をインキュベーターに戻して一晩培養します。細胞を染色するため、増殖培地にMitoTrackerミトコンドリア染色剤とHoechst核染色剤を添加します。この増殖培地を細胞に加え、その後インキュベーションを行います。

次に、室温でHank's平衡塩溶液を用いて5分間インキュベートし、細胞を洗浄します。その後、25 mMの HEPES を含むフェノールレッドフリーの増殖培地を細胞に加え、イメージングを行います。

マイクロニードル実験では、あらかじめ引いたマイクロニードルを、デジタル電荷結合素子（CCD）カメラを備えた倒立顕微鏡に接続されたマイクロマニピレーターに装着します。カメラを用いて、単一細胞の近傍にマイクロニードルをフォーカスさせます。マイクロニードルを細胞骨格に挿入する前の単一細胞の画像を1枚取得してください。

位相差像、hooks 3 3, 3 4 2染色の蛍光像、およびミトコンドリア染色の蛍光像を、倒立顕微鏡の60 x対物レンズで撮影します。マイクロマニピュレーターを用いて、核周辺から一定の距離を保ちながら細胞質にマイクロニードルを慎重に刺入し、位相差像1枚、hooks 3 3, 3 4, 2染色の蛍光像1枚、およびミトコンドリア染色の蛍光像1枚を撮影します。コンピュータ制御のマイクロマニピュレーターを使用し、1 µm/sの速度でマイクロニードルを細胞周辺に向かって特定の距離まで移動させながら、10秒ごとに自動的に画像を収集します。

マイクロニードルを細胞周辺部の特定の距離まで移動させる際、一貫したマイクロマニピュレーションを実現するために、マイクロマニピュレーターをコンピュータで制御する必要があります。一連の手順の最後に、マイクロニードルを除去して画像を取得します。マイクロニードル操作の前、最中、および後に取得した、蛍光ラベル化された核および細胞骨格の特徴の画像が解析され、細胞内微小領域の変位が算出されます。本デモンストレーションでは、解析にカスタム作成したMATLABスクリプトを使用していますが、他にもいくつかの選択肢があります。

マイクロニードルによって生じた変位を測定するためのMATLABスクリプトは、Lambing研究室にリクエストすることで入手可能です。このMATLABプログラムは、正規化相互相関アルゴリズムを使用して、蛍光標識された特徴点の元の位置と、新たに特定された位置との間のシフトを算出します。その後、変位はベクトルマップとして表示され、数値として保存されます。

次のステップでは、得られた変位ベクトルマップを用いて、Matlabで細胞骨格または核内の平均変位を決定します。まず、歪みの印加部位にある細胞骨格内の3点以上の点を選択します。変位ベクトルマップにおいて数値の平均を取り、マイクロニードルの印加中に印加部位付近で生じた細胞骨格の歪み量を決定します。

次に、歪み印加部位に近い核内の3点以上のポイントを選択し、その平均値を算出します。この値が、マイクロニードル印加部位付近の核歪みの量となります。同様の方法を用いて、それぞれの領域から選択したポイントから、歪み印加部位から離れた場所における核および細胞骨格の歪みを決定します。

細胞内での力伝達を測定するため、マイクロニードル操作アッセイを実施しました。ここでは、青色の核染色剤とMIT tracker greenミトコンドリア染色剤で標識した線維芽細胞の位相差像および蛍光像を示しています。マイクロニードルを核から一定の距離を置いた細胞骨格に挿入し、その後、細胞周辺部に向かって移動させました。

細胞骨格に負荷をかける前、最中、および後においてミトコンドリアの変位を追跡し、その変位をベクトルとしてプロットした。各ベクトルは、元の位置と新たに特定された位置との間のずれとして算出された変位を表している。画像強度が低い領域やテクスチャが不十分な領域は、解析から除外した。

次に、対照群の線維芽細胞と線維芽細胞の両方において、歪み印加部位から距離を離した特定の領域で、細胞骨格および核の変位を定量化した。核と細胞骨格の結合が維持されている細胞では、力は細胞全体に伝達されるため、誘導された核および細胞骨格の変形は歪み印加部位から離れるにつれて緩やかに減衰する。対照的に、核と細胞骨格の結合が破壊された細胞では、印加部位付近で局所的な変位が見られ、そこから離れた部位で誘導される変形はわずかである。

コントロールの線維芽細胞と、核・細胞骨格共役を破壊した線維芽細胞の両方において、マイクロニードル挿入部位では同等の細胞骨格歪みの印加が観察されました。しかし、その他の領域で誘発された核および細胞骨格の変位は、コントロール細胞に比べて、核・細胞骨格共役を破壊した線維芽細胞では有意に小さいものでした。したがって、歪みの印加部位から離れた場所での細胞骨格および核の変位の減少は、細胞骨格と核の間の強制伝達が妨げられたことを示しています。

このビデオを視聴することで、核力学および核と細胞骨格間の細胞内力伝達の測定方法について深く理解できるはずです。これらの手法を用いることで、核膜タンパク質の変異の影響や、発生過程または癌において生じる核膜組成の変化について研究することが可能です。