相間細胞核の力学特性を探査する生物物理学的なアッセイ：基板の歪みのアプリケーションおよびマイクロニードル操作

以下の実験の全体的な目的は、界面細胞核の機械的特性および周囲の細胞骨格との物理的な結合を測定することです。これは、透明なシリコン膜上に播種した細胞に機械的な歪みを加え、それによって誘導された核の変形をイメージングすることで達成されます。核の変形が増大することは、核の剛性の低下に対応します。ただし、核と細胞骨格の結合の変化も、誘導される核の変形に影響を与える可能性があります。

細胞骨格に局所的な歪みを加えることで、細胞骨格と核の間の細胞内力伝達を直接的に調査します。その後、蛍光標識された核および細胞骨格構造の変位をイメージングします。これにより、周囲の細胞骨格に対する細胞核の剛性を示す結果が得られます。

基質ストレイン実験に基づくと、マイクロニードル操作アッセイにより、核と細胞骨格のカップリングの破壊が細胞内の力伝達に欠陥を引き起こすことが明らかになります。単離核のマイクロピペット吸引などの既存の手法に対するこれらの技術の主な利点は、通常の細胞構造を乱すことなく、完全な生存細胞における核力学の測定が可能であることです。これらの手法は、核膜組成の変化が核の機械的特性にどのように影響を与えるかについての知見を提供できます。

これらの手法は、LAニューロパチーや癌などの疾患における核力学の役割を研究するためにも適用可能です。各ストレインディッシュは、直径3インチの特製底なしプラスチックディッシュと、細胞培養基質となるシリコンメンブレンを固定するためのプラスチック製Oリングで構成されています。ストレインディッシュを準備するには、4インチ四方のシリコンメンブレンをOリングとディッシュの間に挟んで固定し、余分なメンブレンを慎重に切り取り、ストレインディッシュを脱イオン水で洗浄し、オートクレーブ滅菌します。その後、シリコンメンブレンを細胞外マトリックス分子でコーティングし、メンブレン底面中央の外側に基準点をマークします。

このランドマークは、一軸方向への歪み負荷などの歪み実験において、同一の細胞を特定するのに役立ちます。基準点の周囲にスコッチテープを2本の平行なストライプ状に貼り、膜の形成を一次元に制限します。細胞を最適に接着させるため、シリコン膜を3 µg/mLのフィブロネクチンまたは適切な細胞外マトリックスタンパク質でコーティングしてください。

ストレインディッシュを10 cmのポリスチレン製ディッシュで覆い、4 °Cで一晩インキュベートします。翌日、メンブレンをPBSで1回洗浄し、余分なタンパク質を除去します。ディッシュに10 mLの増殖培地を満たし、そのままにしておきます。

コート済みシリコンメンブレンディッシュの準備が完了したら、0.05% trypsinを用いて細胞を剥離させ、成長培地を用いて接着細胞をディッシュに播種します。この手順をマウス胚性細胞を用いて実演します。

線維芽細胞または中胚葉細胞を、通常の培養条件下で24時間から48時間インキュベートします。基質ストレイン実験用に整備された倒立顕微鏡には、顕微鏡ステージに取り付け可能なベースプレートで構成されるストレイン装置が備わっています。このプレートには中央に円筒形のプラチンが保持されており、これがシリコンメンブラーンの中心部分にストレインを印加させる役割を果たします。

この装置には、ストレインディッシュを保持し、4本のガイドピンに沿って上下にスライド可能な可動プレートと、負荷をかけるための5ポンドの重りが備わっています。核を可視化するために、ストレインディッシュ内の細胞を1 µg/mLのHoechst染色液とともに37 °Cで15分間インキュベートします。インキュベーション後、培地を吸引し、25 mMのHEPESを含むフェノールレッドフリーの増殖培地15 mLと置換します。

次に、ディッシュをディッシュホルダーにねじ込み、シリコンメンブレンが中央の白金（Platin）に沿ってスムーズに滑るように、メンブレン底面の外周に慎重にグリースを塗布します。この際、メンブレンの中央部分は何も塗らずにそのままにしておいてください。ベースプレートを顕微鏡のステージプレート上に置き、ベースプレートにディッシュホルダーを慎重に取り付けます。

初期の静止状態で、ストレインディッシュのシリコンメンブレンが中央のプラチン上に軽く乗っていることを確認します。次に、シリコンメンブレンの底面に焦点を合わせ、中央にある黒色のリファレンスドットを探します。このドットはすべての画像取得の起点となり、ストレッチ中およびストレッチ後に同一の細胞を特定するのに役立ちます。

この画像では、中央のドットが視野全体を覆っています。ドットの境界から始めて、細胞とシリコンメンブレンの上端が見えるように焦点を調整してください。核が中央に位置し、十分に広がった細胞を探します。

位相コントラスト画像を取得し、細胞の輪郭とシリコンメンブレンに焦点を合わせます。次に、核のフック染色（nu nuclear hook stain）の蛍光画像を取得し、核の中心面に焦点を合わせます。5～15個の細胞の画像を取得した後、中心のドットに戻ります。

ウェイトをゆっくりとストレインディッシュに載せ、均一にストレインを印加します。ディッシュの中央に荷重をかけます。基質の最大印加ストレインは、垂直アラインメントピンに配置されたナイロンスペーサーによって制限されます。ストレイン印加後、シリコンメンブレンの底部に焦点を合わせ、リファレンスドットを再び特定し、そのドットを起点とします。

同じ細胞に再度移動し、完全な伸展状態にある各細胞の核の位相差像および蛍光像を取得します。この際、最初の画像の焦点面とできるだけ一致させるようにしてください。細胞が未知の基質に対して能動的な再構築や適応を起こすのを避けるため、この工程は10分以内に完了させる必要があります。すべての対応する画像の取得が完了したら、顕微鏡ステージを開始位置に戻します。

ディッシュホルダープレートからウェイトを慎重に取り除き、必要に応じてシリコンメンブレンを弛緩させます。ストレインディッシュをゆっくりと押し上げ、初期位置に戻します。その後、位相差および蛍光像を取得します。

ストレイン後の細胞の画像（ストレイン画像の記述と同様）および、ストレイン印加前、印加中、印加後の細胞と蛍光標識された核の画像を解析し、正規化された核ストレインを算出します。本デモンストレーションでは、解析にカスタム作成したMATLABスクリプトを使用していますが、手動で基板ストレインを算出する代替オプションもいくつかあります。これは、ストレイン印加前の画像と印加後の対応する画像の間で、膜上に配置された3〜6箇所のコントロールポイントの位置を照合させる方法です。その後、MATLABプログラムが、ストレイン印加前とフルストレイン時の画像における対応するコントロールポイントの位置を比較し、印加された膜ストレインを算出します。

また、訓練前後の画像における残留歪みの位置比較も行います。コントロールポイントを用いて画像ペアを同時にレジストレーションすることで、損傷した細胞や剥離した細胞の検出に役立てます。次に、個々の核の核歪みを算出する別のMATLABプログラムを使用して、手動で核を選択します。

これは、歪み印加前と印加後の対応する蛍光画像間で核のサイズを合わせるか、あるいは核内マーカーを合わせることで、異なる実験間での膜歪みの適用量におけるわずかな変動を補正することによって達成されます。結果は、正規化された核歪みとして表されます。これは、各核について計算された、誘発された核歪みに対する適用された膜歪みの比として定義されます。

MATLABスクリプトは、要請に応じてlambing研究室から入手可能です。最終ステップとして、各核の検証を行い、歪みの印加中に剥離または損傷した細胞からの測定値は除外します。シリコンメンブレン上の2つの異なる領域に広がるMEFを、20%の単軸歪みの印加前、印加中、および印加後に位相差顕微鏡および蛍光顕微鏡で撮影しました。ここに示しているのは、歪みの印加後も損傷や剥離なく生存した細胞から得られた有効な核を含む、成功した実験の例です。

対照的に、ここで示されている細胞は、歪みの印加中に収縮または部分的に剥離しており、解析から除外されています。左側の細胞には細胞骨格の損傷と核の崩壊の兆候が見られ、一方、右側の細胞は歪みの印加中に部分的に剥離し、収縮しています。これは、過剰な歪みが加わったことを示している可能性があります。

ここでは、Lamin AC欠損マウスの異なる一連のMeth細胞株における正規化核歪みの解析を示します。これらの細胞は、野生型リッターメイト由来のMeth細胞と比較して、空ベクトルまたは野生型lamin Aを異所性に発現しています。核膜タンパク質Lamin ACの発現消失により、正規化核歪みが増大します。これは核の剛性が低下していることを示しており、野生型Lamin Aを再導入することで、部分的または完全に回復させることができます。マイクロニードル操作実験の準備として、35 mmのガラスボトム細胞培養ディッシュを低濃度のフィブロネクチンで37 °Cで2時間インキュベートします。インキュベーション後、ディッシュをHBSSで2回洗浄し、2 mLの増殖培地を加えてください。

次に、マウス胚性線維芽細胞を0.05% tryps-inized（トリプシン処理）し、fibronectinコートしたガラスボトムディッシュに2 mLの増殖培地と共に播種します。単一の接着性で非コンフルエントな細胞を得るため、細胞をインキュベーターに戻して一晩静置します。細胞を染色するために、MIT trackerミトコンドリア染色剤およびHoechst核染色剤を増殖培地へ添加します。この増殖培地を細胞に加え、その後インキュベーションを行います。

次に、細胞を室温で5分間、ハンクス平衡塩類溶液（HBSS）でインキュベートして洗浄します。その後、25 mMの HEPES を含むフェノールレッドフリーの増殖培地を細胞に加え、イメージングを行います。

マイクロニードル実験では、あらかじめ作成したマイクロニードルを、デジタル電荷結合素子（CCD）カメラを備えた倒立顕微鏡に接続されたマイクロマニピュレーターに装着します。マイクロニードルを単一細胞の近傍に配置し、ピントを合わせます。マイクロニードルを細胞骨格に刺入する前の単一細胞の画像を1枚撮影します。

位相差像、フック 3 3, 3 4 2 染色の蛍光像、およびミトコンドリア染色の蛍光像を、倒立顕微鏡の 60 x 対物レンズを用いて撮影します。マイクロマニピュレーターを使用して、核周辺から一定の距離を隔てた細胞質にマイクロニードルを慎重に挿入し、位相差像を 1 枚、フック 3 3, 3 4, 2 染色の蛍光像を 1 枚、およびミトコンドリア染色の蛍光像を 1 枚撮影します。コンピューター制御のマイクロマニピュレーターを用いて、10 秒ごとに自動的に画像を撮影しながら、マイクロニードルを細胞周辺方向へ 1 µm/s の速度で特定の距離まで移動させます。

マイクロニードルを細胞周辺部の特定の距離まで移動させる際、一貫したマイクロマニピュレーションを実現するために、マイクロマニピュレーターをコンピュータで制御する必要があります。最終的に、マイクロニードルを除去した後に画像を撮影します。マイクロニードル操作の前、最中、および後に取得した、蛍光標識された核と細胞骨格の特徴を示す細胞骨格画像を用いて、細胞内小領域の変位を算出するための解析を行います。本デモンストレーションでは、解析に独自に作成したMATLABスクリプトを使用していますが、他にもいくつかの選択肢があります。

マイクロニードルによって生じた変位を測定するためのMATLABスクリプトは、Lambing研究室に請求することで入手可能です。このMATLABプログラムは、正規化相互相関アルゴリズムを用いて、蛍光標識された特徴点の元の位置と新しく特定された位置との間のずれを算出します。その後、変位はベクトルマップとして表示され、数値として保存されます。

次のステップでは、得られた変位ベクトルマップを用いて、Matlabで細胞骨格または核内の平均変位を決定します。まず、歪み印加部位の細胞骨格内に3点以上のポイントを選択します。変位ベクトルマップにおいて数値の平均を取り、マイクロニードル印加中に印加部位付近で発生した細胞骨格の歪み量を決定します。

次に、歪み印加部位に近い核内の3点以上の箇所を選択し、その平均値を算出します。この値が、マイクロニードル印加部位付近の核の歪み量となります。同様の方法で、それぞれの領域から選択した点を用いて、歪み印加部位から離れた核および細胞骨格の歪みを決定します。

細胞内力伝達を測定するために、マイクロニードル操作アッセイを実施した。ここでは、青色の核染色およびMIT tracker greenミトコンドリア染色で標識された線維芽細胞の位相差像と蛍光像を示す。マイクロニードルを核から一定の距離の細胞骨格に挿入し、その後、細胞周縁部に向かって移動させた。

細胞骨格への負荷の前、最中、および負荷後のミトコンドリアの変位を追跡し、その変位をベクトルとしてプロットした。各ベクトルは、元の位置と新たに特定された位置との間の移動量として計算された変位を表している。画像強度が低い領域またはテクスチャが不十分な領域は、解析から除外した。

その後、コントロールの線維芽細胞と線維芽細胞の両方について、歪みの印加部位から離れる距離を増しながら、選択した領域における細胞骨格および核の変位を定量化した。核・細胞骨格の結合が維持されている細胞では、力は細胞全体に伝達され、その結果、核および細胞骨格に誘発された変形が生じ、それは印加部位から離れるにつれて緩やかに減衰する。対照的に、核・細胞骨格の結合が破壊された細胞では、印加部位付近で局所的な変位が見られ、そこから離れた部位では誘発される変形がわずかである。

コントロールの線維芽細胞と、核・細胞骨格共役が破壊された線維芽細胞の両方において、マイクロニードル挿入部位では同程度の細胞骨格歪みの適用が観察されました。しかし、その他の領域で誘導された核および細胞骨格の変位は、核・細胞骨格共役が破壊された線維芽細胞において、コントロール細胞よりも有意に小さい結果となりました。したがって、歪みの適用部位から離れた場所での細胞骨格および核の変位の減少は、細胞骨格と核の間の強制伝達が妨げられたことを示しています。

このビデオを視聴することで、核の力学および核と細胞骨格間の細胞内力伝達の測定方法について十分に理解できるはずです。これらの手法を用いて、核膜タンパク質の変異や、発生過程または癌において生じる核膜組成の変化による影響を研究することができます。