臓器レシピエントにおける抗ドナーHLA同種抗体のペプチドアレイベースの検出

臓器提供者のヒト白血球抗原またはセルロース膜上の異なるペプチドを含むHLA配列に由来するペプチドアレイを取ります。

各ペプチドは、ドナーとレシピエントのHLA配列の間に少なくとも1つのアミノ酸のミスマッチを持ち、抗体媒介性臓器拒絶反応の潜在的なエピトープを表しています。

非特異的抗体相互作用を防ぐために、ブロッキングバッファーで処理します。

種抗体を含む臓器移植後に採取されたレシピエント血清を追加します。

ドナーのHLAに対して形成されたこれらの抗体は、標的エピトープに結合します。

同種抗体に結合するペルオキシダーゼ結合二次抗体を追加します。

化学発光基質と過酸化水素を加える。ペルオキシダーゼは過酸化水素を利用して基板を酸化し、発光します。

メンブレンをスキャンして画像を取得します。

バッファーを加えて、結合した抗体をストリッピングします。移植前のレシピエント血清で再プローブし、画像を取得します。

移植前の画像と比較して、移植後の画像の黒い斑点は、同種抗体反応性を刺激するドナー特異的HLAエピトープを示しています。

アレイが合成されたら、0.1%トゥイーン20またはTBSTを含むトリス緩衝生理食塩水に溶解した20ミリリットルの5%脱脂乳でメンブレンをブロッキングしながら適切なインキュベーション期間の間、ブロックします。次に、メンブレンを20ミリリットルの新鮮なTBSTで洗浄ごとに5分間3回洗浄し、続いて20マイクロリットルの粗レシピエント血清をTBST中の2.5%ミルクに室温で2〜3時間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、メンブレンを洗浄ごとに10分間3回洗浄し、ヤギ抗ヒト西洋わさびペルオキシダーゼ結合IgG二次抗体とメンブレンを2時間インキュベートします。

TBSTで10分間の洗浄を3回行い、結合していない二次抗体を除去し、5ミリリットルの新たに調製したルミノール溶液と5ミリリットルの過酸化物溶液で膜を現状化します。1分後、適切なイメージャーで強化された化学発光シグナルを視覚化します。

現像画像を保存した後、メンブレンを20ミリリットルの市販のストリッピングバッファーとともに摂氏37度で20分間インキュベートし、その後TBSTで10分間3回洗浄します。次に、異なる時点で得られた同じ患者からの血清サンプルで示したように、膜をブロックし、再プローブし、視覚化します。