JoVE 実験百科事典
免疫学
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カバーガラスで海馬ニューロン培養物のサンプルを3つ採取します。
表面発現グルタミン酸受容体を標識するために一次抗体を導入します。
コンディショニング培地を2番目と3番目のサンプルに追加して、抗体結合受容体のエンドサイトーシスを誘導します。
3番目のサンプルに、Fabフラグメントを追加して、非エンドサイトーシス抗体上のエピトープをブロックします。
阻害剤を導入して受容体エンドサイトーシスをブロックし、受容体の表面へのリサイクルを可能にします。
すべてのサンプルで、細胞を固定し、ブロッキング溶液を追加して、非特異的標識を防ぎます。
蛍光色素タグ付き二次抗体を導入して、リサイクルされた受容体を含む表面結合受容体上の一次抗体を標識します。
細胞膜を透過化します。
一次抗体を最初のサンプルに再度追加して、既存のエンドサイトーシス受容体を標識します。
すべてのサンプルに異なる蛍光色素タグ付き二次抗体を導入して、エンドサイトーシス受容体結合一次抗体を標識し、エンドサイトーシス受容体と表面結合受容体を区別します。
共焦点顕微鏡を使用して、さまざまな処理で表面発現、エンドサイトーズ、およびリサイクルされた受容体を定量
化します。この手順を開始するには、カバーガラスをセル側をパラフィンフィルムで覆われたトレイに移して、試薬を節約し、操作を容易にします。コンディショニングされた培地を摂氏37度で保存し、インキュベーションおよび洗浄ステップに維持します。
コンディショニング培地で希釈した一次抗体と細胞を室温で15分間インキュベートします。この後、真空ピペットを使用して抗体含有培地を慎重に吸引し、コンディショニングされた培地で細胞を3回洗浄します。
表面受容体発現と細胞内受容体の発現を研究する場合は、テキストプロトコルに概説されているように、このステップの後に細胞をパラホルムアルデヒドで固定します。抗体を含まないコンディショニング培地に細胞を保持し、摂氏37度のインキュベーターに戻して内在化を可能にします。内在化プロセスを研究する場合は、テキストプロトコルに概説されているように、このステップの後に細胞をパラホルムアルデヒドで固定します。
内在化されていない表面発現受容体に結合した一次抗体のエピトープをブロックするには、コンディショニング培地で希釈した非結合Fab抗IgG抗体フラグメントと細胞を室温で20分間インキュベートします。この後、調整された培地で細胞を3回洗浄します。洗浄したウェルを摂氏37度で80マイクロモルのダイナソールを含むコンディショニング培地でインキュベートし、内在化された受容体のリサイクルを可能にします。
生細胞での修飾が終わったら、PBS+で細胞を一度洗浄します。PBS中の4%パラホルムアルデヒドと4%スクロースの溶液を細胞に加え、室温のヒュームフードで7〜8分間インキュベートして細胞を固定します。次に、通常のPBSで細胞を3回洗浄します。PBS中の10%正常ヤギ血清の溶液を細胞に加え、室温で30分間インキュベートして非特異的結合部位をブロックします。
次に、PBS中で3%NGSで希釈した蛍光タグ付き二次抗体と細胞を室温で1時間インキュベートし、一次抗体標識受容体を標識します。この後、細胞をPBSで3回洗浄します。
細胞内受容体の標識を開始するには、PBS中に0.25%Triton-Xの溶液を加え、室温で5〜10分間インキュベートして細胞を透過させます。次に、室温で10%NGSで30分間ブロックします。表面対全体を研究する場合は、以前に使用したのと同じ一次抗体で細胞をインキュベートし、室温でPBS中の3%NGSで1時間希釈して、細胞内受容体を標識します。
次に、細胞をPBSで3回洗浄します。室温で1時間、PBS中の3%NGSで希釈した2番目の蛍光タグ付き二次抗体で標識します。この後、細胞をPBSで3回洗浄します。まず、カバーガラスをセル側を下にして、12〜15マイクロリットルの適切な封入剤にそっと置き、セルをマウントします。次に、適切な共焦点顕微鏡で細胞を画像化し、テキストプロトコルで概説されているように細胞を分析します。