カルシウム指示色素を用いたT細胞受容体誘導性カルシウム流入の評価

マウスT細胞懸濁液から始めて、カルシウム指示色素であるインド-1-アセトキシメチルエステルを導入します。

色素は細胞に入り、そこで細胞内エステラーゼがアセトキシメチル基を切断して膜不透過性のインド-1を形成し、カルシウムフリーおよびカルシウム結合の形態で明確な蛍光を示します。

Fc受容体抗体を添加して、非特異的相互作用部位をブロックします。

蛍

光色素標識抗体を導入して、T細胞サブセットを染色します。

結合していない抗体を除去し、生細胞と死細胞を異なる染色する生存率色素で染色します。

フローサイトメトリーでは、最初に生細胞の薄暗い蛍光を検出し、蛍光色素タグ付きT細胞を同定し、次にこれらの細胞内のIndo-1蛍光を測定します。

T 細胞受容体 CD3 複合体と相互作用して T 細胞シグナル伝達経路を活性化し、細胞質ゾルへのカルシウム流入を誘導する抗 CD3 抗体で治療します。

Indo-1 色素は放出されたカルシウムイオンと相互作用し、色素の蛍光を青から紫にシフトします。

インド-1蛍光がカルシウムフリー状態からカルシウム結合状態にシフトしたことで、T細胞受容体によるカルシウム流入が確認されています。

まず、50マイクログラムのIndo-1 AMを含むバイアルに50マイクロリットルのDMSOを加えて、1マイクロリットルあたり1マイクログラムのIndo-1 AMストック溶液を調製します。原液を1ミリリットルあたり6マイクログラムの濃度で適切な量のcRPMIに希釈します。

培地を摂氏37度のウォーターバスに入れます。次に、この培地を使用して、事前に調製した細胞懸濁液を1対1の比率で希釈し、ミリリットルあたり5〜600万個の細胞を取得します。次に、12ウェルの組織培養プレートに、実験条件ごとにウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を追加します。

Indo-1色素負荷細胞にEGTAを添加することにより、カルシウムフリーのIndo-1 AM用の単一染色コントロールサンプルを調製します。蛍光色素やインド-1色素を使用せずに生物学的陰性対照用のウェルを修復します。フローサイトメーターで色素を充填した細胞懸濁液に50マイクロモルの濃度でイオノマイシンを添加することにより、インド-1ポジティブコントロールを調製します。

また、抗体標識蛍光色素を使用して、追加の細胞集団の単一染色コントロール用のウェルを調製します。次に、100万細胞あたり2マイクログラムのFC受容体遮断抗体を加え、プレートを45分間インキュベートし、15分ごとにタップして細胞を再懸濁します。

インキュベーション後、プレートから細胞の全量を混合して取り出し、1.7ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。上清を遠心分離してデカントします。細胞を1ミリリットルの予熱したcRPMIで洗浄したら、再びペレット化し、上清をデ