カルシウム指示色素を用いたT細胞受容体誘導性カルシウム流入の評価

マウスT細胞懸濁液から始めて、カルシウム指示色素であるインド-1-アセトキシメチルエステルを導入します。

色素は細胞に入り、そこで細胞内エステラーゼがアセトキシメチル基を切断して膜不透過性のインド-1を形成し、カルシウムフリーおよびカルシウム結合の形態で明確な蛍光を示します。

Fc受容体抗体を添加して、非特異的相互作用部位をブロックします。

光色素標識抗体を導入して、T細胞サブセットを染色します。

結合していない抗体を除去し、生細胞と死細胞を異なる染色する生存率色素で染色します。

フローサイトメトリーでは、最初に生細胞の薄暗い蛍光を検出し、蛍光色素タグ付きT細胞を同定し、次にこれらの細胞内のIndo-1蛍光を測定します。

T 細胞受容体 CD3 複合体と相互作用して T 細胞シグナル伝達経路を活性化し、細胞質ゾルへのカルシウム流入を誘導する抗 CD3 抗体で治療します。

Indo-1 色素は放出されたカルシウムイオンと相互作用し、色素の蛍光を青から紫にシフトします。

インド-1蛍光がカルシウムフリー状態からカルシウム結合状態にシフトしたことで、T細胞受容体によるカルシウム流入が確認されています。

まず、50マイクログラムのIndo-1 AMを含むバイアルに50マイクロリットルのDMSOを加えて、1マイクロリットルあたり1マイクログラムのIndo-1 AMストック溶液を調製します。原液を1ミリリットルあたり6マイクログラムの濃度で適切な量のcRPMIに希釈します。

培地を摂氏37度のウォーターバスに入れます。次に、この培地を使用して、事前に調製した細胞懸濁液を1対1の比率で希釈し、ミリリットルあたり5〜600万個の細胞を取得します。次に、12ウェルの組織培養プレートに、実験条件ごとにウェルあたり1ミリリットルの細胞懸濁液を追加します。

Indo-1色素負荷細胞にEGTAを添加することにより、カルシウムフリーのIndo-1 AM用の単一染色コントロールサンプルを調製します。蛍光色素やインド-1色素を使用せずに生物学的陰性対照用のウェルを修復します。フローサイトメーターで色素を充填した細胞懸濁液に50マイクロモルの濃度でイオノマイシンを添加することにより、インド-1ポジティブコントロールを調製します。

また、抗体標識蛍光色素を使用して、追加の細胞集団の単一染色コントロール用のウェルを調製します。次に、100万細胞あたり2マイクログラムのFC受容体遮断抗体を加え、プレートを45分間インキュベートし、15分ごとにタップして細胞を再懸濁します。

インキュベーション後、プレートから細胞の全量を混合して取り出し、1.7ミリリットルの微量遠心チューブに加えます。上清を遠心分離してデカントします。細胞を1ミリリットルの予熱したcRPMIで洗浄したら、再びペレット化し、上清をデカントします。

細胞を1ミリリットルのcRPMIに再浮遊し、各チューブをインキュベートし、チューブの上部をガス交換のためにわずかに開いたままにして、細胞内AMエステルの完全な脱エステル化を可能にします。次に、ユーザー定義のすべての蛍光色素結合抗体のマスターミックスを調製し、それを細胞体積の1ミリリットルの静止細胞に加えます。

安静後、細胞をペレット化し、摂氏4度に冷やした1ミリリットルのcRPMIに再懸濁してペレットを洗浄します。この手順を繰り返し、チューブを氷の上に置きます。キャップ付きの5ミリリットルのポリスチレンフローチューブを使用して、500マイクロリットルのフェノールレッドフリーcRPMIに個々のサンプルを再懸濁します。

カルシウムフラックス分析で温度を維持するには、小さな水浴にバスビーズを加えてビーズバスを準備し、摂氏37度まで温めます。50ミリリットルの円錐形のチューブを慎重に半分に切り、チューブの上部を捨てます。残りのチューブの3/4をバスビーズで満たし、ビーズバスで摂氏37度に達するまで待ちます。

ビーズバスをフローサイトメーターの近くに置き、チューブを配置するための発泡スチロールラックを置きます。フローサイトメーターで分析する前に、チューブを個別に摂氏37度に7分間温めます。フローサイトメーターソフトウェアにログインし、「ライブラリ」タブをクリックします。

次に、蛍光タグを選択して、カルシウム結合のインド-1とカルシウムを含まないインド-1を追加します。次に、蛍光タググループでUVレーザーを選択し、プラス追加をクリックして蛍光タグ名を追加します。レーザー励起と発光の波長を選択し、[保存]をクリックします。

実験の設定に進みます。[取得]タブをクリックします。新しい実験を開くか作成し、目的の蛍光タグを実験に追加します。実験の参照グループと新しいサンプル グループを作成し、両方のグループにラベルを付けます。

取得] タブで、記録するイベントを最大 1,000 万、停止ボリュームを最大容量 3,000 マイクロリットル、停止時間を最大 36,000 秒に設定します。マルチカラーパネルに含まれるユーザー定義の標識抗体と、Indo-1機能性色素の単一染色コントロールを取得します。

カルシウム結合のインド-1ポジティブコントロールとボルテックスに50マイクロモルのイオノマイシンを加えます。フローチューブをサンプル注入ボードに追加し、[記録]をクリックします。次に、カルシウムフリーのIndo-1陰性対照をフローサイトメーターに追加し、[記録]をクリックします。

[Unmix]ボタンをクリックして、単一染色されたコントロールをアンミックスします。アンミックスが完了したら、サンプルからデブリを除去するためのSSCA対FSCA、ダブレットを除去するためのSSCA対SSCHなど、非混合ワークシートを使用してシーケンシャルプロットを作成します。

次に、[プロット]をクリックしてゲートを作成します。ワークシートにプロットを追加し、ゲート内側をダブルクリックして、下流のゲート母集団を作成します。関心のあるすべての母集団が説明されるまで続けます。次に、事前に調製した単一染色の対照サンプルを摂氏37度に温めて、逐次分析を行います。

フローサイトメトリーソフトウェアをセットアップし、脱イオン水を2〜3分間流して、フローサイトメーターの流体安定性を確保します。多角形、長方形、または楕円ゲート ボタンを使用してゲートを作成し、対象の母集団を含めることで、混合されていないワークシートに連続プロットを設定します。

ゲート内側をダブルクリックし、y軸とx軸のパラメータをSSCAとSSCHに変更します。軸を左クリックして、軸パラメータの定義を完了します。SSCA対生存率色素シグナルを含むプロットを作成します。陰性またはアミン色素染色の生細胞をゲートします。

生死染色陰性の生細胞は、y軸とx軸の両方のゼロマークにクラスター化します。内側のプロットをダブルクリックして、単一細胞の生リンパ球のみを含む新しいプロットを作成します。カルシウム流入を視覚化するために、x 軸の y 軸を 1 対時間に変更します。

次に、温めた生体サンプルを機械のSITに入れます。サンプルを中流速で毎秒2,500〜3,000イベントで実行し、限られた数の細胞集団におけるカルシウムの流入を視覚化します。次のチューブをビードバスに追加します。

取得コントロールで、記録を押して初期データを30秒間記録し、サンプル中のカルシウムシグナル伝達の基礎レベルを取得します。次に、[停止]をクリックし、サンプル注入ポートからチューブを取り外します。30マイクログラムの非抱合型抗CD3をサンプルチューブに直接加えて、カルシウムの流入を開始します。

チューブをサンプル注入ポートにすばやく戻し、ソフトウェアで[記録]を押します。ソフトウェアの集録制御下で経過した時間を観察しながら、7分間データを記録します。次に、ソフトウェアで停止を押します。