好中球タンパク質の単離と消化

好中球を含むチューブから始めます。タンパク質分解を防ぐために、プロテイナーゼ阻害剤を含むバッファーを追加します。

好中球膜を透過性化するために適切な界面活性剤を追加します

氷浴で、高周波音波でサンプルを超音波処理して細胞膜を破壊し、さまざまなタンパク質を含む細胞内内容物を放出します。

短時間遠心分離してチューブ壁から内容物を収集し、適切なチューブに移します。

還元剤を導入し、高温でインキュベートすると、ジスルフィド結合の切断が促進され、タンパク質が変性します。

冷却

して、スルフヒドリル基をアルキル化するアルキル化試薬を導入します。

冷たいアセトンを加えてタンパク質の沈殿を誘導します。

遠

心分離してタンパク質と細胞断片をペレット化します。上清を取り除き、自然乾燥させます。

変性剤を含む緩衝液を導入し、超音波処理してタンパク質ペレットを再可溶化します。

最後に、タンパク質を切断するプロテアーゼミックスを追加します。さらなる処理のためにサンプルを保管します。

まず、サンプルを400倍gで5分間遠心分離することにより、好中球分化HL60細胞を15ミリリットルのチューブに収集します。

15ミリリットルのPBSを加えて細胞ペレットを2回洗浄し、400回gで5分間再度遠心分離します。

プロテイナーゼ阻害剤カクテル錠を含む氷冷の100ミリモルトリスHCl pH 8.5を300マイクロリットルの各サンプルに加え、短時間ボルテックスします。

次に、20%SDSを1×10体積で最終濃度2%に添加し、氷浴中でサンプルを30秒間オン、30秒間オフ、10%の出力で5サイクルプローブ超音波処理します。

チューブ壁からスプレーオフを回収するには、細胞破片がペレットを形成しないように、サンプルを最高速度で5〜10秒間遠心分離します。

サンプルを15ミリリットルチューブから2ミリリットルチューブに移し、1 x 100容量の1モルストックジチオスレイトールを最終濃度10ミリモルまで添加します。

短時間ボルテックスした後、サンプルを摂氏95度で10分間インキュベートし、800rpmで振とうします。次に、サンプルを氷の上に置いて室温まで冷却します。

次に、暗所条件で、1 x 10 容量の 0.55 モルヨードアセトアミドを最終濃度 55 ミリモルまで添加し、チューブをボルテックスしてから、室温で暗所で 20 分間インキュベートします。

インキュベーションの最後に、100%氷のように冷たいアセトンを最終濃度80%まで加えます。サンプルを摂氏マイナス20度で一晩保管します。後で使用するために最大2週間保管してください。

翌日、サンプルを摂氏4度で10分間13,500rpmで遠心分離し、細胞ペレットを沈殿させます。500マイクロリットルの80%氷冷アセトンを加えて細胞ペレットを2回洗浄し、続いて13,50