ペプチドの脱塩と精製のためのSTAGEチップ手順

小型精製カラムであるSTop And Go ExtractionまたはSTAGE Tipを取ります。

チップには、疎水性相互作用ベースのペプチド精製のために、長い炭化水素鎖に結合した小さなシリカビーズが含まれています。

セトニトリルを多く含む緩衝液で洗浄し、樹脂の不純物を除去します。

結合バッファーと遠心分離機を導入し、最適なペプチド結合のためにカラムを平衡化します。

プチドフラグメントと塩を含む不純物を含む、分化した好中球様細胞から得られた事前消化済みペプチドサンプルをロードします。

心分離機でサンプルをカラムに通します。ペプチドフラグメントは疎水性相互作用を介して炭化水素鎖に結合し、塩は除去されます。

結合バッファーを加えて遠心分離し、残りの不純物を除去します。

溶出のために高アセトニトリル含有バッファーを導入します。

シリンジを使用して、バッファーをカラムに通します。アセトニトリルは炭化水素鎖に結合し、緩衝液で溶出するペプチドフラグメントを置換します。

プロテオミクスプロファイリングを実行して、精製されたペプチドを同定します。

まず、200マイクロリットルのピペットチップにC18樹脂を3層詰めて、各ペプチドサンプルのSTop And Go抽出またはSTAGEチップを構築します。

以前にインキュベートしたペプチドサンプルの酵素消化を停止し、1 x 10容量の停止溶液を加えます。サンプルを13,200rpmで10分間遠心分離し、上清を新しい2ミリリットルチューブに移します。

次に、STAGEチップを100マイクロリットルの100%アセトニトリルで洗浄し、STAGEチップを1000gで2分間、またはすべての液体がC18樹脂を通過するまで遠心分離します。

同じ遠心分離条件で、50マイクロリットルのバッファーBでSTAGEチップ洗浄を繰り返し、続いて200マイクロリットルのバッファーA

サンプルをSTAGEチップにロードし、1000 gで3〜5分間遠心分離します。次に、1000 gで3〜5分間遠心分離することにより、STAGEチップを200マイクロリットルのバッファーAで洗浄します。

次に、各STAGEチップに50マイクロリットルのバッファーBを加え、シリンジを使用して、バッファーBを含むサンプルを0.2ミリリットルのPCRチューブに溶出します。

サンプルが溶出したら、真空遠心分離機を使用してペプチドを45分間乾燥させます。テキスト原稿に記載されている条件で、高分解能質量分析でサンプルを実行します。

プロテオミクスプロファイリング用にデータを処理するには、質量分析から得られた生データファイルをMaxQuantソフトウェアにアップロードします。ソフトウェアのすべてのパラメータとその調整については、テキスト原稿を参照してください。

グローバルパラメータでは、Uniprotデータベースからダウンロードした配列同定用のホモサピエンスのFASTAファイルをインポートし、生物ID、タンパク質の数、およびファイルのダウンロード日を記録します。

処理するコンピューター コアの数を設定し、[開始] を選択します。MaxQuantが完了すると、「結合」フォルダと、データリポジトリへのアップロードに必要な他のファイルが生成されます。

データを分析するには、「proteingroups.txt」をPerseusにアップロードし、すべてのラベルフリー定量化ファイルまたはLFQ強度ファイルを「メイン」ウィンドウに選択します。汚染物質、逆ペプチド、およびサイトのみで識別されたペプチドを除去して行をフィルタリングし、データをログ₂(x)で変換します。

各反復で検出されたタンパク質の数を観察するには、数値ベン図を作成し、1つの生物学的サンプルのすべての反復に同じ名前を付けて、各サンプルにカテゴリアノテーションを設定します。

有効な値に基づいて行をフィルタリングし、反復の50%以上で、少なくとも1つのグループ内で同定されたタンパク質を使用します。LFQ の欠損値を置き換えるには、正規分布からの代入を実行します。

PerseusのWebサイトからダウンロードしたアノテーション情報を、txt.gz FASTAファイルを「bin」、「conf」、「annotation」フォルダに追加してタンパク質行に追加します。タンパク質名、遺伝子名、遺伝子オントロジーなどの特定の用語を取り込みます。

でマトリックスが完成し、主成分分析プロット、ヒートマップ、カテゴリエンリッチメントなどのツールで視覚化できます。統計的検査を実行して、テストされた条件間のタンパク質存在量の有意な変化を判断します。