機能性SARS-CoV-2中和抗体の評価

重症急性呼吸器症候群コロナウイルス 2 または SARS-CoV-2 に対するさまざまな濃度の中和抗体を含む連続希釈ヒト血清から始めます。

SARS-CoV-2スパイクタンパク質を含む脂質二重層内にカプセル化されたルシフェラーゼRNA、インテグラーゼ、逆転写酵素を含む疑似型ウイルスを導入します。

抗体は血清希釈に基づいてウイルスを中和し、希釈率が低いほど最大の中和を示します。

アンジオテンシン変換酵素-2受容体またはACE2受容体を発現する標的細胞と膜貫通プロテアーゼセリン-2またはTMPRSS2を導入します。

より高い血清希釈では、中和されていないウイルスはACE2受容体と相互作用し、TMPRSS2はスパイクタンパク質を切断してウイルス融合を可能にします。

侵入すると、ルシフェラーゼRNAはDNAに逆転写され、宿主ゲノムに組み込まれてルシフェラーゼ酵素を産生します。

培地をルシフェラーゼ基質と溶解剤を含むアッセイバッファーと交換します。

細胞は溶解し、細胞内ルシフェラーゼを放出し、基質と相互作用して高い発光を生成します。

血清希釈液全体の発光を定量化して、ウイルス中和率を決定します — 50% の中和を達成した希釈液は、中和力価を表します。

まず、10%のFBSと1%のペニシリン-ストレプトマイシンを含む50マイクロリットルのDMEMを、白い96ウェルプレートの列BからH、列1から12

5マイクロリットルの回復期血清を、10%のFBSと1%のペニシリン-ストレプトマイシンを含む100マイクロリットルのDMEMの合計量で、行A、列2〜10のウェルに加えます。対照として、5マイクロリットルの陽性および陰性抗血清をウェルA11およびA12に加えます。

行Aのウェルから50マイクロリットルの溶液を取り出し、その下のすべてのウェルを2倍に連続希釈します。希釈ごとに、マルチチャンネルピペットを使用して、気泡を発生させずに上下にピペッティングして溶液を5〜10回混合します。

段階希釈が完了したら、各カラムの最後のウェルから最後の50マイクロリットルを廃棄します。

プレートを毎分500回転で1分間遠心分離し、ウェルの壁に液体が残らないようにします。テキスト原稿に記載されているように、SARS-CoV-2 PVを希釈するために必要なDMEMの量を計算します。

釈したPV溶液をピペット洗面器で混合し、セルのみのコントロールを構成するウェルA6〜A12を除き、50マイクロリットルを各ウェルに分注します。A1 から A6 の井戸は、PV のみの制御として機能します。

毎分500回転で1分間遠心分離し、ウェルの壁にウイルスが残らないようにします。次に、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素とともに1時間インキュベートし、血清がSARS-CoV-2糖タンパク質と結合できるようにします。

次に、ACE2 と TMPRSS2 プラスミドを 24 時間前にトランスフェクトした HEK 293T/17 標的細胞のプレートを調製します。プレートから培地を取り出し、細胞の剥離を避けるために皿の片側に加えて、2ミリリットルのPBSで2回洗浄します。

PBSを廃棄し、2ミリリットルのトリプシンをプレートに加えます。細胞が剥がれるまでプレートをインキュベーターに入れます。

細胞が剥離したら、10%FBSと1%ペニシリン-ストレプトマイシンを含む6ミリリットルのDMEMをプレートに加えてトリプシン活性を消光し、細胞を穏やかに再懸濁します。

自動セルカウンターを使用するか、チャンバースライドをカウントして細胞をカウントします。1 x 10 4細胞を総量50マイクロリットルで分注して各ウェルに加え、プレートを摂氏37度で5%の二酸化炭素で48〜72時間インキュベートします。

インキュベーション後、すべてのウェルから培地を取り出し、PBSと市販のルシフェラーゼアッセイ試薬の1:1混合物を25マイクロリットル加えます。マイクロプレートルミノメーターを備えた市販のルシフェラーゼアッセイシステムを使用してプレートを読み取ります。

ルミノメーターによって生成された生データを使用して、テキスト原稿に記載されているように、IC50中和抗体価を計算します。