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合成
糖脂質をマウスに腹腔内注射することから始めます。
抗原提示細胞(APC)は、糖脂質を内在化し、非古典的なMHC分子CD1dを介して提示します。
APCは脾臓に移動し、不変のナチュラルキラーT細胞またはiNKT細胞と相互作用し、iNKT細胞の活性化と増殖を誘導します。
脾臓を収穫します。機械的に解離して単一細胞懸濁液を生成する。
細胞をチューブに移します。密度勾配培地を加え、遠心分離してリンパ球を分離します。
リンパ球を採取します。iNKT細胞と相互作用する糖脂質抗原をロードした蛍光色素標識CD1d四量体を追加します。
結合していない四量体を取り除きます。四量体結合蛍光色素に結合する磁性マイクロビーズで重ね合わせます。
結合していないビーズを取り除き、細胞懸濁液を磁気カラムにロードします。
磁場下では、ビーズ結合したiNKT細胞はカラムに保持され、残りの細胞は流れます。
磁場からカラムを取り除きます。溶出バッファーを加えてiNKT細胞を溶出します。
通常のDBA / 1マウスにα-GalCerを体重1キログラムあたり0.1ミリグラムの用量で腹腔内注射します。モデリングの3日後、麻酔後、マウスの脾臓を単離します。200メッシュのふるいで脾臓を切断して粉砕することにより、単一細胞懸濁液を調製します。細胞懸濁液をPBSで洗浄します。200回gで5分間遠心分離し、上清を廃棄します。
1ミリリットルの全血および組織希釈液で細胞を再懸濁します。3ミリリットルのマウスリンパ球分離培地を加え、室温で300倍gで細胞を20分間遠心分離します。
iNKT細胞を精製するには、10〜7個の細胞を摂氏4度のPBSの100マイクロリットルで再懸濁します。10マイクロリットルのα-GalCerを充填したCD1dテトラマー-PEを加え、暗所で摂氏4度で15分間インキュベートします。細胞をPBSで2回洗浄し、80マイクロリットルのPBSに再懸濁します。20マイクロリットルの抗PEマイクロビーズを加え、暗所で摂氏4度で20分間インキュベートします。それらをPBSで2回洗浄し、細胞を500マイクロリットルのPBSで再懸濁します。
選別カラムをMACS選別機の磁場に入れ、500マイクロリットルのPBSですすいでください。調製した細胞懸濁液を選別カラムに加え、フロースルーを回収し、PBSバッファーで3回すすぎます。磁場を取り除き、1ミリリットルのPBSバッファーを選別カラムに加えます。プランジャーを一定の圧力で素早く押して、標識された細胞を収集チューブに押し込み、精製されたiNKT細胞を取得します。自動セルカウンターでカウントします。