キメラ抗原受容体T細胞を作製するex vivo技術

初代T細胞を、インターロイキン-2を添加した培地で抗体結合磁気ビーズと混合し、インキュベートします。

抗体は T 細胞受容体複合体および共刺激受容体 CD28 の CD3 に結合し、インターロイキン 2 はその同族受容体に結合して T 細胞の活性化と増殖を引き起こします。

キメラ抗原受容体またはCARをコードするトランスジェニックRNAを持つレンチウイルスベクターを導入し、インキュベートします。

ベクターと細胞膜の融合により、ウイルスRNAはDNAへの逆転写を受け、宿主ゲノムに組み込まれます。

形質導入されたT細胞は、表面結合CARを発現します。

定義された間隔で細胞を採取します。

凍結保存の場合は、細胞のアリコートを取り、ピペッティングによって結合したビーズを切り離し、磁気的に分離します。

細胞をスピンダウンし、凍結保存培地に再懸濁します。

細胞を凍結し、極低温で保存します。

CAR発現を評価するには、細胞の別のアリコートを取り、細胞をスピンダウンし、バッファーに再懸濁します。

CAR特異的蛍光タグ抗体を導入し、フローサイトメトリーを使用してCAR発現を検出します。

新鮮または凍結保存された初代ヒトT細胞を、培養皿のウェルでT細胞あたり3ビーズの比率で抗CD3/CD28磁気ビーズと混合することにより活性化します。正常なヒトAB血清、L-グルタミン、HEPES、およびIL-2を添加したX-VIVO15培地でT細胞を培養します。

増殖時に1ミリリットルあたり100万個のT細胞の濃度でT細胞を活性化し、酸素20%、二酸化炭素5%、湿度95%の摂氏37度で培養します。一晩刺激した後、活性化されたT細胞にレンチウイルス上清を加えます。3〜5の感染の多様性を達成するために必要な上清の量を計算します。同じ条件で細胞の培養を続けます。

3日目に、凍結保存の細胞の代表的なアリコートを収集します。凍結保存の前に、穏やかなピペッティングと磁気分離によって磁気ビーズを除去します。0.5%DMSOを含むPBSを含む凍結培地を準備し、使用する準備ができるまで摂氏4度で保存します。

次に、T細胞を300倍gで5分間遠心分離します。上清を捨て、5ミリリットルのPBSを加えます。細胞を再び300回gで5分間遠心分離し、PBSを廃棄します。ペレットを1ミリリットルの冷たい凍結保存培地に再懸濁します。T細胞を冷やした冷凍容器で凍結し、マイナス80°Cで48時間保存します。

この後、凍結した細胞を液体窒素に移します。残りのT細胞を5ミリリットルのPBSで1回洗浄して、残留ベクターを除去します。300 g で 5 分間遠心分離し、PBS をデカントし、細胞ペレットを T 細胞培養培地に 500,000 細胞/ミリリットルの濃度で再懸濁します。

T細胞を5日目と9日目用に設計された2つの培養物に分割