混合3D培養における標的細胞排除のための近赤外光免疫療法

成長因子受容体と蛍光タンパク質を発現する標的細胞からなる不均一な細胞凝集体である吊り下げ滴混合スフェロイドの培養を取りますが、非標的細胞は異なる色の蛍光タンパク質を発現します。

培地を、標的細胞特異的モノクローナル抗体と光吸収剤色素を含む抗体-光吸収体複合体に置き換えます。

標

的細胞受容体への抗体結合を促進するためにインキュベートします。

ス

フェロイドを培地で洗浄して結合していない抱合体を除去し、光照射のために培地を入れたガラス底皿に移します。

光免疫療法のためにスフェロイドを近赤外光にさらし、標的細胞上で光吸収色素の光化学反応を引き起こし、急速な細胞膜損傷と細胞死を引き起こします。

このプロセスにより、非標的細胞に損傷を与えることなく標的細胞が除去されます。

スフェロイドを新しい吊り下げドロッププレートに移します。培地を加え、スフェロイド成長のためにインキュベートします。

蛍光顕微鏡下では、標的細胞蛍光がないことは効果的な細胞除去を示し、非標的細胞蛍光の存在は光免疫療法の選択的性質を裏付けます。

混合3D細胞培養を調製するには、96ウェルの吊り下げ式ドロッププレートのプレートリザーバーセクションに1ミリリットルの滅菌水を加えます。次に、適切な細胞培養培地に、ウェルあたり培地50マイクロリットルあたり少なくとも5000細胞で、摂氏37度および5%二酸化炭素の加湿インキュベーター中で5〜7日間、目的の細胞型のさまざまな比率をプレートします。

培地を2日ごとに交換し、10〜40倍の倍率の倒立明視野顕微鏡でスフェロイドの形態とサイズを毎日観察します。スフェロイドの直径が400〜600ミクロンに達したら、吊り下げ式ドロッププレート培地を抗体光吸収体複合体含有培地に交換し、プレートをインキュベーターに6時間戻します。

インキュベーションの最後に、スフェロイドを新鮮なフェノールレッドフリー培地で2回洗浄します。次に、端がカットオフされた200マイクロリットルのピペットチップを使用して、一度に1つのスフェロイドを、ディッシュごとに100マイクロリットルの新鮮なフェノールレッドフリー培地を含む個々のガラス底の50ミリメートルディッシュに移します。倒立顕微鏡を使用して、スフェロイド形態の変化を観察します。

回転楕円体を照射するには、ガラス底皿の上5インチ以下の発光ダイオードを置き、光パワーメーターを使用して、2ジュール/センチメートルの波長で670〜710ナノメートルの波長の発光を確認します。近赤外光免疫療法の後、スフェロイドを細胞培養インキュベーターでウェルあたり50マイクロリットルの新鮮な培地を含む新しい吊り下げ式ドロッププレートに1日移します。

次に、端がカットオフされた別の200マイクロリットルのピペットチップを使用して、スフェロイドを100マイクロリットルのフェノー