臍帯血造血幹細胞を分離してヒト免疫系マウスを作製

CD34⁺ 造血幹細胞 (HSC) を含むヒト臍帯血細胞から始めます。

抗体を添加して細胞性Fc受容体をブロックし、HSC特異的磁気ビーズの非特異的結合を防ぎます。

CD34⁺ HSCを標的とする抗体でコーティングされた磁気ビーズを導入します。遠心分離して上清を廃棄します。

細胞をバッファーに再懸濁します。それらを磁気分離器に通して、ビーズ結合HSCを保持します。結合していない細胞が流れます。

磁場を除去してHSCを収集します。

細胞を遠心分離し、増殖培地に再懸濁します。細胞をプレートしてインキュベートします。

培地には、HSCの生存と増殖を促進する成長因子とサイトカインが含まれています。

細胞を採取します。凍結培地を加え、クライオバイアルに移し、凍結します。

ヒト免疫系(HIS)マウスモデルを生成するには、HSCを解凍します。それらを予熱培地に加えます。

細胞を遠心分離し、バッファーに再懸濁します。

細胞は、HISモデル生成のために免疫不全マウスの子犬に注射する準備ができています。

まず、臍帯血から単離したCD34陽性細胞ペレットを、1 x 10⁸細胞あたり300マイクロリットルの磁気細胞分離器バッファーに再懸濁します。1 x 10⁸細胞あたり100マイクロリットルのFcRブロッキング試薬を加え、続いて1 x 10⁸細胞あたり100マイクロリットルのCD34陽性磁気ビーズを加え、摂氏4度で30分間インキュベートします。

次に、1 x 10⁸細胞あたり5ミリリットルの磁気細胞分離緩衝液を加え、摂氏4度で10分間360 gで回転させます。洗浄ステップを繰り返し、「未分画」とラベル付けされた15ミリリットルの円錐形チューブに、磁気細胞分離器バッファー1億細胞あたり500マイクロリットルのペレットを再懸濁します。さらに2本の15ミリリットルチューブ(CD34陰性とCD34陽性)にラベルを付けます。3本のチューブを冷却ラックに置きます。

バイオセーフティキャビネット内の自動磁気細胞分離器の2列ポジティブセレクションプログラムを使用して細胞を分離します。次に、CD34陽性のヒト幹細胞を増殖および凍結するために、原稿に記載されているように臍帯血またはCB培地を調製し、0.22ミクロンのフィルターに通します。CD34陽性細胞をCB培地1ミリリットルあたり100,000に再懸濁し、摂氏37度でインキュベートします。

3日目に、サイトカインを含まない同量のCB培地をフラスコに加えます。5日目に、増殖したCD34陽性細胞を採取します。細胞懸濁液を上下にピペットで移動させ、50ミリリットルの円錐形チューブに集めます。フラスコの底を覆うのに十分なCB培地を追加します。セルスクレーパーを使用して、フラスコの底全体をこすります。すべての培地を同じ50ミリリットルのチューブに集め、遠心分