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初代脾臓細胞と混合したレトロウイルスベクターを取ります。
ベクターには、腫瘍特異的抗原を標的とするキメラ抗原受容体またはCARをコードするトランスジェニックRNAが含まれています。
培地中のサイトカインインターロイキン-2は、他の細胞が最終的に死滅する間、T細胞の増殖を選択的に促進します。
混合物を組換えフィブロネクチンフラグメントでコーティングされたマイクロプレートに移します。
遠心分離して、フィブロネクチンフラグメントがベクターとT細胞に結合し、ウイルスと宿主細胞の相互作用を媒介し、インキュベートします。
ベクターのエンベロープと細胞膜が融合すると、ウイルス酵素は放出されたRNAをDNAに逆転写し、宿主ゲノムに取り込みます。
形質導入されたT細胞は、腫瘍特異的抗原を標的とする細胞外抗体可変フラグメントと、抗原に応答する細胞内シグナル伝達領域からなる表面結合CARを発現します。
細胞をチューブに移す前に再懸濁します。
遠心分離して、内在化されていないウイルスを含む上清を廃棄し、下流のアッセイのために細胞をバッファーに再懸濁します。
脾臓摘出術の翌日に、1ミリリットルあたり25マイクログラムの組換えヒトフィブロネクチンフラグメントまたはRHFFを含むPBSを調製し、各ウェルに0.5ミリリットルの溶液を加えて、非組織培養処理された24ウェルプレートをコーティングします。翌日、ウェルから溶液を取り出し、PBS中の2%BSAのウェルあたり1ミリリットルを加えます。
室温で30分間インキュベートし、プレートをしっかりとひっくり返してBSAを除去してから、2ミリリットルのPBSを加えて洗浄します。HEK293T細胞からウイルス上清を採取した後、RHFFでコーティングされたウェルの数にさらに3ミリリットルを加えたものに等しい最終容量(ミリリットル単位)に新鮮なTCMを加えます。
培養した脾細胞をインキュベーターから取り出し、各ウェルで2〜3回静かに上下にピペッティングして再懸濁します。細胞懸濁液を50ミリリットルのコニカルチューブに移します。次に、脾細胞をウイルス上清に1 x 106細胞/ミリリットルに再懸濁します。
次に、ウェルあたり1ミリリットルの脾細胞懸濁液をRHFFコーティングプレートのウェルに加えます。次に、プレートを摂氏 32 度、770 g秒で 90 分間回転させ、加速度 4、破断設定を 0 にします。スピン中に、TCMで組換えヒトIL-2のミリリットルあたり50国際単位を準備します。
スピン後、プレートの各ウェルに1ミリリットルの培地を加え、一晩インキュベートします。T細胞が80%を超えるコンフルエンスに達した場合は、各ウェルで2〜3回ゆっくりと上下にピペッティングして細胞を分割し、各ウェルから1ミリリットルを新鮮な24ウェル組織培養処理プレートの新しいウェルに移します。
1ミリリットルの新鮮なTCMを、IL-2ミリリットルあたり50国際単位を各ウェルに加えます。細胞が80%のコンフルエンスを超えない場合は、各ウェルの上部から1ミリリットルの培地をゆっくりとピペッティングし、組換えヒトIL-2の1ミリリットルあたり50国際単位を含む1ミリリットルの新鮮なTCMと交換して、培地の半分を変更します。
各ウェルで3回静かに上下にピペッティングしてCAR T細胞を再懸濁し、250ミリリットルの遠心分離管に移します。細胞を300 gで10分間回転させます。次に、ペレットを乱すことなく上清を完全に吸引します。PBSを使用して細胞を洗浄し、2回目の洗浄前に細胞をカウントします。典型的なCAR T細胞の収量は、ウェルあたり約1 x 106細胞です。