T細胞の遺伝子編集のためのCRISPR-Cas9技術

電気パルスが細胞膜に一時的な細孔を作成するプロセスであるエレクトロポレーションに適した培地に懸濁されたT細胞を取ります。

Cas9タンパク質と単一のガイドRNAまたはsgRNAを含む複合体を追加します。sgRNAは、分子はさみであるCas9を切断のためにDNA上の特定の位置に誘導する小さなRNAです。

Cas9-sgRNA複合体を細胞内に輸送するのを助ける短い一本鎖DNA分子を追加します。

この混合物をキュベットに移し、短い電気パルスを印加してエレクトロポレーションを開始します。

このプロセスにより、複合体が細胞に入ることができます。

sgRNAはT細胞DNAの標的部位に結合し、Cas9がDNAを編集できるようにし、両方の鎖に切断を作成します。

この破壊は、修復タンパク質にサイトへの信号を送ります。

その後、修復タンパク質が末端を再接続し、遺伝子を機能しなくなります。

遺伝子編集されたT細胞を、下流のアッセイに適した培地でインキュベートします。

10マイクログラムのCas9ヌクレアーゼを5マイクログラムのシングルガイドRNAとともに室温で10分間インキュベートすることにより、リボ核タンパク質またはRNP複合体を調製します。単一のガイドRNAを使用しないモックコントロールを含めます。再懸濁したT細胞をRNP複合体と結合し、4.2マイクロリットルの4マイクロモルエレクトロポレーションエンハンサーを加えます。よく混合し、エレクトロポレーションキュベットに移します。

パルスコードEH-1-11を使用してセルを電気めっきします。次に、1ミリリットルあたり500万個の細胞をR-10でインキュベートし、1ミリリットルあたり5ナノグラムのヒトIL-7およびヒトIl-15を摂氏30度で12ウェルプレートで48時間インキュベートします。インキュベーション後、T細胞の活性化と増殖を進めます。