多価表示外膜小胞ワクチンの作製

ポリマーに結合した標的プラスミドを含むトランスフェクションポリプレックスを取ります。プラスミドは、ペプチドタグとアフィニティータグに融合したウイルス抗原をコードします。

プレックスを哺乳類細胞とインキュベートし、エンドソーム内のポリプレックスを内在化します。

ポリマーは小胞の破裂を誘発します。放出されたプラスミドは、細胞外で分泌されるウイルス抗原を発現します。

抗原と汚染物質を含む上清を採取します。競合薬剤を低濃度で添加します。

アフィニティークロマトグラフィーカラムにロードします。

アフィニティータグはカラム樹脂に結合して抗原を固定化しますが、競合剤は非特異的結合を減少させます。

競合剤を低濃度で流し、弱く結合した汚染物質を除去します。

合する薬剤の濃度を上げて洗浄し、強く結合した抗原を置換し、溶出させます。

細菌の外膜小胞(OMV)を表面結合捕捉タンパク質とともに導入し、インキュベートします。

抗原ペプチドタグは捕捉タンパク質に結合し、多価抗原表示を備えたOMVワクチンを形成します。

OMV SpyCatcherの精製を実行します。細菌溶液の遠心分離から始めます。上清を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、中空糸カラムを使用して濃縮します。濃縮液を0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、超遠心分離機を用いて摂氏4度で150,000倍gで2時間遠心分離し、ピペットで上清を廃棄します。沈殿物をPBSで再懸濁し、摂氏マイナス80度で保存します。

RBD-SpyTagトランスフェクションを実行するには、適切な真核生物の発現システムを選択することから始め、回復後、摂氏37度で毎分130回転で一晩細胞を培養します。20マイクロリットルHEK293Fの細胞溶液を自動セルカウンターに加えます。セルの数を記録します。濃度を1ミリリットルあたり10〜6番目の細胞の1倍に調整し、37°Cで毎分130回転で4時間培養します。

RBD-SpyTagプラスミドを0.22マイクロメートルのメンブレンフィルターでろ過し、最終容量が10ミリリットルになるまで300マイクログラムのプラスミドを細胞培養培地に加えます。10秒間振ってください。PEIをウォーターバスで摂氏65度に加熱します。0.7ミリリットルのPEIと9.3ミリリットルの細胞培養培地を混合し、10秒間断続的に振とうします。

PEI溶液にプラスミド溶液を加えます。混合物を10秒間断続的に振とうし、摂氏37度で15分間インキュベートします。混合物を280ミリリットルの細胞培養培地に加え、摂氏37度で毎分130回転で5日間培養します。

次に、RBD-SpyTagの精製を行います。細胞を摂氏25度で6,000倍gで20分間遠心分離することから始めます。ピペットを使用して上清を収集します。2ミリリットルのニッケル-NTAアガロースでカラムを作成し、PBSで3回洗浄します。

イミダゾールを細胞上清に加えて最終濃度を20ミリモルにし、細胞上清をロードします。洗浄用に20ミリモルのイミダゾールを含むPBSを3カラム添加し、洗浄画分を収集します。低濃度から高濃度のイミダゾールを含む 3 カラム容量の PBS でグラジエント溶出します。濃度ごとに2回溶出します。

BCA法でタンパク質濃度を決定するには、標準BSAタンパク質溶液を1ミリリットルあたり2〜0.0625ミリグラムに連続希釈します。精製したOMV SpyCatcherとRBD-SpyTagを10倍に希釈します。次に、BCA作業溶液AとBを50対1の比率で混合します。希釈したタンパク質溶液を加え、BCA作業溶液と混合します。摂氏37度で30分間インキュベートします。各ウェルの562ナノメートルでの吸光度を測定し、標準曲線からタンパク質濃度を計算します。

OMV SpyCatcherとRBD-SpyTagのバイオコンジュゲーションを行うには、PBSのRBD-SpyTagにOMV SpyCatcherを40対1の比率で混合します。垂直に回転させて、摂氏 15 度で毎分 4 回転で一晩混合物をブレンドします。OMV SpyCatcher精製と同様の手順を使用して、PBS溶液を使用してOMV RBDの精製を実行します。